尖吻蝮蛇毒组分I对人口腔鳞状细胞癌HN4细胞凋亡及自噬的影响

黄婷婷，柴 琳，王振杰，俞 玲

0 引 言

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC），简称口腔癌，恶性程度较高，约占颌面部恶性肿瘤的90%以上［1］。口腔癌的发病率在世界范围内呈上升趋势，虽然治疗上已经取得了许多重要进展，然而口腔癌的发病率和死亡率仍居高不下，患者的生存质量及预后情况不理想［2］。因此，寻求一种新的、有效的治疗方法是目前治疗口腔鳞状细胞癌的研究热点。自噬和凋亡是两个重要的细胞过程，是细胞对各种应激所致的细胞损伤做出应答。自噬是一种依赖溶酶体的降解途径，是一种普遍存在的生命现象［3］，它是细胞降解的重要途径［4-5］。自噬还参与多种病理生理过程。有研究表明，自噬的活性与肿瘤的发生密切相关［6-7］。因此，研究自噬发生的机制并有目的的干预，进而有效地控制自噬水平，对研究肿瘤的治疗方法将会是一个新的突破。细胞凋亡是指机体细胞在受到内源性或外源性信号刺激时，凋亡控制基因程序被激活，经过多条信号通路传递的自杀性保护过程。线粒体凋亡途径是细胞凋亡的重要途径之一，是由线粒体介导的内源性凋亡途径。有研究发现，高水平的自噬可能引起线粒体等细胞器的过度降解，并促进细胞死亡［8-9］。

尖吻蝮蛇毒组分I（component I from Agkistrodon Acutus Venom，AAVC-I）是将皖南五步蛇粗毒经过Cellulose DE-52 离子交换和Sephadex G-75 分子筛两步层析后获得的一种抑瘤组分，酸性蛋白质，相对分子质量为27 kD，研究表明AAVC-I 具有明显的抑制肿瘤细胞增殖和促进凋亡的效应［10］。并且AAVC-I 在肺癌细胞及白血病细胞中可以通过线粒体凋亡途径促进肿瘤细胞的凋亡［6-7］。本实验研究探讨AAVC-I 对人口腔鳞状癌细胞的促凋亡作用及对自噬的影响，为今后口腔鳞癌的进一步研究和新药研发提供有利的依据和参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料人口腔鳞状细胞癌HN4 细胞来自于皖南医学院病理生理教研室。胎牛血清购于美国Sigma 公司。AAVC-I 来自于皖南医学院蛇毒研究所。MTT 试剂盒购于南京凯基生物科技发展有限公司。β-actin 抗体和活化的半胱氨酸蛋白酶-3（Cleaved Caspase-3）抗体购于美国Cell Signaling Technology 公司。线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）、Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒购于碧云天生物技术研究所。自噬微管相关蛋白轻链3（LC3）抗体购于Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及给药将AAVC-I 冻干粉溶于培养基中，配制不同浓度的AAVC-I。将培养的HN4细胞分为4 组：对照组，AAVC-I 低浓度组，AAVC-I中浓度组，AAVC-I 高浓度组。AAVC-I 低、中、高浓度组分别给予2.5、5、10 μg/mL AAVC-I处理，对照组在同一时间给予相等剂量的溶剂（2 mL的培养基）。

1.2.2 HN4 细胞培养将人口腔鳞状癌HN4 细胞复苏后接种于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养液中，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养，并进行常规传代，取对数生长期细胞进行相关实验。

1.2.3 MTT 检测肿瘤细胞的抑制率MTT 法测定HN4细胞增殖活性，取对数生长期HN4细胞，接种于96孔板。按1.2.1方案分组，每组6个复孔。培养24 h，去上清。每孔加入配制好的MTT 50 μL，在37℃培养箱中孵育4 h，去上清，每孔加入150 μL 二甲基亚砜（DMSO），振荡10 min，在酶联检测仪上570 nm波长处检测光密度（OD）值，重复3次。

1.2.4 免疫蛋白印迹法（Western blot）检测给予AAVC-I 24 h 后，收集细胞用胰酶消化细胞，离心半径8 cm、1000 r/min，离心5 min，使用细胞裂解液裂解细胞，离心，提取总蛋白。用15%SDS-PAGE 胶电泳分离所提取的蛋白，将蛋白转到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜上，将带有目标蛋白的膜裁好并加入5%脱脂牛奶4℃封闭1 h，然后根据抗体说明书孵育一抗和内参过夜，第2 天用TBST 缓冲液漂洗10 min×3 次，用辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗孵育2 h，再用TBST漂洗10 min×3次，ECL 发光液试剂盒暗室曝光。蛋白水平用UN-SCAN-IT 软件（Silk Scientific Inc.，Orem，UT，USA）处理分析。

1.2.5 免疫组织化学染色法检测Caspase-3 的表达量制作细胞爬片。药物作用24 h 后，取适量0.5%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100），处理20 min，3%H2O2室温放置10 min，吸取液体立即滴加适量山羊血清封闭液，然后在37℃温箱中封闭30 min。一抗孵育4℃冰箱中过夜，PBS 清洗2 min×3 遍。二抗37℃孵育30 min，PBS 清洗2 min×3 遍后，滴加链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（SABC）试剂，37℃温育30 min，PBS 清洗2 min×3 遍。最后，二氨基联苯胺（DAB）显色及梯度酒精脱水。

1.2.6 JC-1 法检测线粒体膜电位根据试剂盒说明书，设置阳性对照组，配制JC-1 染色工作液。药物作用24 h 后，每孔加入1 mL JC-1 染色工作液，充分混匀，在细胞培养箱37℃孵育20 min。然后吸除上清，每孔取适量的JC-1缓冲液（1×）清洗2遍。

1.2.7 免疫荧光法检测LC3 蛋白的表达量制作细胞爬片。取适量破膜液完全破膜，滴加牛血清白蛋白（BSA）孵育30 min 进行血清封闭，加一抗4℃孵育，加二抗避光孵育50 min。取适量DAPI染液滴加在片子上，避光室温孵育10 min。洗涤3 次，每次5 min。等片子稍甩干后，用抗荧光淬灭封片剂封片。

1.2.8 流式细胞仪检测细胞凋亡给予AAVC-I 24 h 后收集细胞。用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶消化后离心，收集细胞。先用冷PBS 洗涤细胞，1000×g 离心5 min，弃上清，加入400 μL Annexin V结合液轻轻重悬细胞并进行细胞计数。再加入5 μL Annexin V-FITC，轻轻混匀2～8 ºC 孵育15 min；加入10 μL 碘化丙啶染色液，轻轻混匀2～8ºC 孵育5 min。立即上流式细胞仪检测，重复3次。

1.3 统计学分析采用SPSS 18.0 软件进行统计学处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，以P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 AAVC-I 对HN4 细胞增殖的影响不同浓度的AAVC-I 作用24 h 后，随着AAVC-I 浓度的增加，AAVC-I 低、中、高浓度组HN4 细胞的增殖抑制率呈上升趋势。AAVC-I 低、中、高浓度组与对照组比较差异均有统计学意义（P<0.05），但AAVC-I低浓度组与AAVC-I 中浓度组之间差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.2 Western blot 法检测Cleaved Caspase-3 的蛋白表达AAVC-I 处 理HN4 细 胞24 h 后，随 着AAVC-I 浓度增加，Cleaved Caspase-3 表达增加，提示细胞凋亡增加。组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图1，表2。

表1 不同浓度AAVC-I对HN4细胞增殖的抑制作用（±s）

表1 不同浓度AAVC-I对HN4细胞增殖的抑制作用（±s）

与对照组比较，*P<0.05、**P<0.01；与AAVC-I中浓度组比较，#P<0.05

图1 各组Cleaved Caspase-3的蛋白表达量

表2 Western blot法检测各组Cleaved Caspase-3的蛋白表达量比较（±s）

表2 Western blot法检测各组Cleaved Caspase-3的蛋白表达量比较（±s）

与对照组比较，*P<0.05、**P<0.01；与AAVC-I低浓度组比较，#P<0.01；与AAVC-I中浓度组比较，△P<0.05

2.3 免疫组化法检测Cleaved Caspase-3 的表达不同浓度AAVC-I 处理HN4 细胞24 h 后Cleaved Caspase-3 蛋白表达增加，与对照组比较，随着AAVC-I 浓度的增加Cleaved Caspase-3 蛋白表达水平上调，组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图2，表3。

表3 不同浓度AAVC-I 处理HN4 细胞后Cleaved Caspase-3蛋白表达量比较（±s）

表3 不同浓度AAVC-I 处理HN4 细胞后Cleaved Caspase-3蛋白表达量比较（±s）

与对照组比较，*P<0.05、**P<0.01；与AAVC-I低浓度组比较，#P<0.01；与AAVC-I中浓度组比较，△P<0.05

图2 免疫组化法检测各组Caspase-3的表达（×200）

2.4 JC-1法检测线粒体膜电位不同浓度AAVC-I作用HN4细胞24 h后，与对照组比较，AAVC-I不同浓度组随着AAVC-I 浓度的增加，红色荧光逐渐减少，绿色荧光逐渐增加。各组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05），见表4。

2.5 免疫荧光法检测LC3 蛋白的表达量不同浓度的AAVC-I 作用24 h 后，随着AAVC-I 浓度的增加细胞数量逐渐减少，免疫荧光法检测LC3 蛋白的表达量结果显示：与对照组比较，AAVC-I 低、中、高浓度组LC3 蛋白的表达量逐渐增加（P<0.05）。见图3，表5。

2.6 AAVC-I 处理后HN4 细胞的凋亡情况流式细胞仪检测HN4 细胞凋亡情况显示，随着AAVC-I药物浓度的增加，细胞凋亡率也随着药物浓度增加而逐渐增加，并且各组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图4，表6。

表4 不同浓度AAVC-I 对HN4 细胞线粒体膜电位的影响（±s）

表4 不同浓度AAVC-I 对HN4 细胞线粒体膜电位的影响（±s）

与对照组比较，*P<0.05、**P<0.01；与AAVC-I 低浓度组比较，#P<0.05、##P<0.01；与AAVC-I中浓度组比较，△P<0.01

表5 不同浓度AAVC-I 处理HN4 细胞后LC3 蛋白的表达量比较（±s）

表5 不同浓度AAVC-I 处理HN4 细胞后LC3 蛋白的表达量比较（±s）

与对照组比较，*P<0.05、**P<0.01；与AAVC-I低浓度组比较，#P<0.01；与AAVC-I中浓度组比较，△P<0.01

图3 免疫荧光检测AAVC-I处理后LC3蛋白的表达量（×200）

图4 不同浓度AAVC-I对HN4细胞凋亡的影响

表6 不同浓度AAVC-I 处理HN4 细胞后细胞凋亡情况（±s）

表6 不同浓度AAVC-I 处理HN4 细胞后细胞凋亡情况（±s）

与对照组比较，*P<0.05、**P<0.01；与AAVC-I低浓度组比较，#P<0.01；与AAVC-I中浓度组比较，△P<0.01

3 讨 论

口腔癌状细胞癌是危害人类健康和生命常见的恶性肿瘤之一，严重影响患者的生存质量和精神状态，据报道全球每年新增患者约10万人［11］。目前口腔癌的临床治疗手段并不能完全治愈，只能延缓疾病进程，缓解患者症状［12］，且中晚期患者的5年生存率依旧很低［13-14］。毒蛇作为一种天然的药用资源，具有广泛的生物学活性，其中在抗肿瘤方面具有广阔的应用前景。大量研究表明，从蛇毒粗度中提取的活性成分除了抗凝、促凝、止痛等功效外，还具备传统抗肿瘤药物所具有的功效［15］。而从皖南地区尖吻蝮蛇提取物（AAVC-I）同样具有抗肿瘤作用，本研究主要探索AAVC-I 在人口腔鳞癌HN4 细胞中诱导肿瘤细胞凋亡的作用以及对自噬的影响。

细胞凋亡是细胞为维持内环境稳定，由基因控制的自主而有序的死亡过程。线粒体调节膜电位并控制细胞程序性死亡，当其受到不良刺激，线粒体内膜与外膜接触位点处生成通透性转变孔道，会使线粒体膜通透性提高，引起线粒体跨膜电位不可逆下降，从而导致细胞凋亡［16-17］。线粒体膜通透性增加也能使诱导凋亡因子（AIF）等分子释放进入细胞质基质，破坏细胞结构。Bcl-2 相关X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）具有促进细胞凋亡的作用。Bax 具有孔形成能力，并能诱导细胞色素C 从线粒体释放入胞浆［17-18］，在dATP存在时与凋亡蛋白酶激活因子（Apaf-1）结合并激活Caspase-9，后者继而激活Caspase-3。Caspase-3是Caspase 家族中最重要的凋亡执行者之一，是凋亡途径下游进行底物酶解的关键蛋白酶，被认为是整个凋亡级联反应的关键调节点［19-20］。自噬是依赖溶酶体对大分子蛋白质和某些细胞器进行降解再利用的过程，基础水平的自噬对细胞具有保护作用，但高水平自噬也有可能过度降解细胞器，促进细胞凋亡［21］。结合相关文献及本研究结果显示，AAVC-I可能通过某些途径上调Caspase-3 蛋白的表达水平，并具有浓度依赖性，JC-1检测结果表明Caspase-3蛋白的表达水平可能与细胞膜电位的改变有关，同时免疫荧光检测到LC3 表达增加，表明AAVC-I 可提高HN4 细胞的自噬水平，提示AAVC-I 对口腔鳞癌细胞的促凋亡作用可能是通过降低线粒体膜电位引起Caspase-3的表达增加，并提高自噬水平。

综上所述，AAVC-I 对HN4 细胞有抑制其增殖、诱导其凋亡作用，这可能是通过降低线粒体膜电位进而上调Caspase-3 蛋白的表达及提高自噬水平实现的。凋亡和自噬两者的相互关系及转换机制还需要详细的研究［22］。本实验的研究结果可为今后研究口腔鳞癌治疗方法提供有利依据，但是细胞的凋亡过程较为复杂，又有多种基因参与细胞的凋亡，因此AAVC-I 在人口腔鳞癌细胞中的凋亡诱导机制还有待进一步的研究。