IL17A在卵巢癌中的表达水平及潜在机制的生物信息学分析

陈 娟，刘传丽，陈艳思，王振国，孔祥玲

0 引 言

卵巢恶性肿瘤是女性常见的肿瘤之一，其中以上皮癌最多见，卵巢上皮癌死亡率居于各妇科肿瘤之首［1］。由于卵巢体积小，且发病时缺乏典型症状，难以早期发现，这使得挖掘可以提示肿瘤发生及预后的标志物，并探索其分子调控机制成为卵巢癌防治的关键［2-3］。越来越多的研究证明［4-5］，炎性微环境对于恶性肿瘤的发生及进展具有重要作用，白细胞介素-17（interleukin-17，IL-17）家族是衔接肿瘤与炎症的关键炎症因子之一，其中IL-17A 是该家族中最具代表性的成员［6］。既往研究多着重于比较外周血中IL-17A 表达水平高低与临床指标的相关性，欠缺长期随访数据以及相关分子机制的深入探讨［7-8］。为此本研究首先从临床样本出发，验证卵巢癌患者肿瘤组织与癌旁组织IL-17A 表达变化差异，随后借助公开临床数据库-肿瘤基因组图谱（the cancer genome atlas，TCGA）及生物信息学手段分析IL-17A与患者生存率的相关性，以及IL-17A 调控肿瘤的潜在分子机制，为卵巢癌的防控提供新的线索。

1 资料与方法

1.1 研究对象选取我中心妇科2018年1月至11月间收治的原发性卵巢浆液性囊腺癌患者20例，年龄39～72岁，临床分期为Ⅰ期4例、Ⅱ期8例、Ⅲ期8例。纳入标准：①病理证实为卵巢浆液性囊腺癌；②均为首次进行手术，手术范围包括子宫全切+双附件切除+大网膜及盆腔淋巴结清扫；③无远处转移；④术前均未接受化疗或放疗。排除标准：①存在心、肝、肾等重要脏器疾患；②有自身免疫性疾病，或近期存在感染。本研究经医院伦理委员会批准（批准号：WJ201712024），患者均签署知情同意书。

1.2 标本采集及检测根据术中快速冰冻病理结果，分别提取肿瘤组织及癌旁正常组织，-80℃保存。待所有样本收集完毕后，采用ELISA 法检测IL-17A 水平。人IL-17A 试剂盒购自美国R&D Systems公司，酶标仪购自美国Thermo Scientific 公司，检测过程严格按照说明书进行。

1.3 生物信息学分析

1.3.1 数据来源及生存曲线分析从Omisc 软件（http：//www.linkedomics.org）下载卵巢浆液性囊腺癌患者mRNA 数据集，筛选出同时包含IL-17A 表达水平测定和完整临床数据的病例共549例，按照IL-17A 表达水平由高到低排序，将排在前50%的患者设为高表达组（n=275），剩余患者设为低表达组（n=274），应用GraphPad Prism绘制2组患者生存曲线。

1.3.2 IL-17A 相关基因筛选选取包含IL-17A 表达水平测定的RNA 基因芯片数据共549例，共检测基因5309个，利用在线分析工具（http：//www.linkedomics.org/admin.php）将各基因表达水平逐一与IL-17A 表达水平进行Pearson 相关性检测，选取与IL-17A 表达呈正相关且相关系数最高50个基因，以及与IL-17A表达呈负相关且相关系数最高50个基因，分别绘制基因热图［9］。

1.3.3 富集分析选取P<0.05 且相关系数绝对值排在前100 的基因，使用DAVID 在线生物信息学分析工具（https：//david.ncifcrf.gov/）进行生物学注释和分类，即完成基因本体（gene ontology，GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书通路（the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes Pathway，KEGG 通路）富集分析。GO 富集分析又分为生物学过程、细胞组分和分子功能三个类型。

1.4 统计学分析使用SPSS 17.0 软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用两独立样本t 检验，生存时间的比较使用Gehan-Breslow-Wilcoxon 分析，相关基因筛选采用Pearson 相关性分析。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 卵巢癌组织与癌旁组织IL-17A 水平比较癌组织IL-17A 表达水平［（7.23±2.11）ng/L］显著高于癌旁正常组织［（4.19±1.33）ng/L］，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.2 IL-17A 表达水平差异对生存曲线影响IL-17A 高表达组中位生存时间高于IL-17A 低表达组，差异有统计学意义［1451 d vs 1348 d，风险比（HR）=0.74，95%CI为0.60～0.92，P<0.05］，见图1。

2.3 IL-17A 相关基因筛选结果在检测的5309个基因中，有2103个基因与IL-17A 存在相关性（P<0.05），见图2a。与IL-17A 表达呈正相关且相关系数最高50个基因见图2b，与IL-17A 表达呈负相关且相关系数最高50个基因见图2c。其中钙电压门控通道亚单位α1（calcium voltage-gated channel subunit alpha1 S，CACNA1S）与IL-17A 表达水平相关系数最高（r=0.6928，P<0.05），见图2d。

图1 IL-17A高表达组与低表达组远期生存率比较

2.4 GO 富集分析和KEGG 通路富集分析GO 富集分析结果显示，主要涉及的生物学过程包括生物调节、刺激反应和多细胞生物过程，主要涉及的细胞组分为细胞膜、细胞核和囊泡，主要涉及的分子功能为蛋白质结合、离子结合和转运活性，见图3。KEGG 通路富集分析显示，主要涉及的信号通路为泛醌10 和其他萜类醌的生物合成、三磷酸腺苷（ATP）绑定蛋白转运、类固醇生物合成、补体和凝血级联反应、神经活性配体-受体相互作用和神经突触激活，见图4。

图2 与IL-17A相关性较高的基因筛选结果

图3 与IL-17A呈正、负相关的前50个基因的GO富集分析

图4 与IL-17A 呈正、负相关的前50个基因的KEGG 通路富集分析

3 讨 论

恶性肿瘤的发生发展与其所处微环境密切相关，炎性细胞及相关炎症因子是肿瘤微环境的重要组成部分。慢性炎症可促进肿瘤恶变，同时恶变的肿瘤细胞还可主动募集炎性细胞，形成适宜生长的炎性环境［10-11］。IL-17 是T 辅助细胞17（T helper cell 17，Th17）分泌的炎症因子，其中IL-17A 作为IL-17家族的主要成员，在自身免疫性疾病和过敏性疾病中扮演重要角色［12］。近期研究发现，其在卵巢癌的发生与发展中同样发挥重要作用。陈献等［13］发现卵巢癌患者癌组织中IL-17A 阳性率显著高于卵巢交界性肿瘤和良性卵巢肿瘤患者的肿瘤组织，熊雯等［14］亦发现卵巢癌患者血清中IL-17 表达显著上调。本研究通过卵巢浆液性囊腺癌患者肿瘤组织的检测发现，IL-17A 在癌组织中的表达显著高于癌旁组织，这与多数研究结果一致，这可能是由于慢性炎症的存在可削弱机体的免疫功能，促进肿瘤血管生成及肿瘤细胞的增殖、转移［15-17］。

但是亦有研究发现，IL-17在促进肿瘤内部的血管生成和肿瘤细胞迁移侵袭的同时，又可通过增强细胞毒性T细胞活性从而抑制肥大细胞瘤及浆细胞瘤的生长，即IL-17 在肿瘤的形成中具有双重作用［18］，这提示需要更多的临床随访数据去观察IL-17A 与恶性肿瘤患者预后的关系，以便于进一步探讨IL-17A 的作用机制并制定防治策略。TCGA 数据库在过去的十余年里收录了加拿大和美国地区11 000 多例肿瘤组织以及相匹配的正常组织，和约2.5 PB 的高通量基因组测序结果，TCGA 创建的基因组数据分析流程，可有效收集、选择和分析组织基因组改变，并结合收录患者的诊断和治疗信息，为改进癌症预防、早期检测和治疗提供了强大的研究基础［19］。本研究通过对TCGA 数据库中549例卵巢浆液性囊腺癌患者的随访数据进行分析后发现，IL-17A 表达水平升高提示预后良好，这与Lan 等［20］的研究结果类似，其通过对104例卵巢癌患者的随访发现，IL-17高表达与晚期卵巢癌中无进展生存期的改善相关。这可能由于肿瘤细胞在募集炎症因子的同时，炎症因子本身也可作为一种第二信使，刺激肿瘤细胞微环境中免疫细胞的聚集，特别是T细胞，从而增强肿瘤细胞的清除，IL-17A 介导的细胞杀伤作用强于慢性炎症带来的肿瘤血管生成作用，故呈现为IL-17A高表达促进了患者远期生存率的提高。

但是IL-17A 具体作用的靶点尚不明确，为此本研究基于TCGA 数据库中的基因检测结果，筛选出与IL-17A 表达密切相关的基因，并进行富集分析，以求挖掘出潜在机制。结果可见，CACNA1S 与IL-17A 表达水平相关性最为明显。CACNA1S 基因位于染色体1q31-32 上，编码L-型钙通道的主要功能单位α1 亚基。al 亚基包含4个同源的结构域，它们排列对称，围成中间的亲水通道，随膜电位发生变化而形成构象变化，调节通道的开闭［21-22］。研究结果提示卵巢浆液性囊腺癌的发展与电压门控通道的改变存在相关性，这可能是由于前列腺素、趋化因子、炎性细胞因子等可间接或直接作用于细胞表面受体，影响胞内外的电化学梯度，使胞内Ca2+浓度发生改变，影响肿瘤细胞的增殖与肿瘤血管形成。

GO 富集分析结果提示，多数相关基因与蛋白质结合和生物调节相关，编码蛋白主要定位于细胞膜，这也与筛选出的CACNA1S 基因功能高度一致。KEGG 通路富集分析显示，相关基因主要集中于泛醌10 和其他萜类醌的生物合成通路。泛醌10 又称辅酶Q10，与多数类固醇、类萜等生物分子类似，主要由乙酰辅酶A 经甲羟戊酸途径合成［23］，作为线粒体氧化呼吸链中的内源性抗氧化剂和电子载体，其在肿瘤细胞中可参与铁死亡过程。铁是人体生理活动中不可缺少的元素之一，近年来研究表明铁元素可参与线粒体氧化磷酸化，并可促使细胞产生过量活性氧，进而损害核酸、蛋白质和脂质等大分子物质，导致细胞死亡，这种新的细胞死亡形式被称为铁死亡［24］。在卵巢恶性肿瘤组织，以及卵巢癌起始细胞模型中膜铁转运蛋白含量可显著减少［25］，也提示铁代谢异常可促进卵巢癌细胞的增殖。

综上所述，本研究通过临床标本验证了IL-17A在卵巢癌中的表达差异，及其与预后的相关性，并进一步基于IL-17A从数据库挖掘卵巢癌的潜在作用机制，发现IL-17A 相关基因的功能特征主要富集在细胞膜表面的电压门控通道的调控及细胞凋亡过程，为IL-17A的临床价值提供了生物信息学证据支持。