Box-Behnken效应面法优化马齿苋中总黄酮提取工艺*

李 伟 赵浩男 杨星星 杨锦颖 曲晓兰

药学院，山东第一医科大学(山东省医学科学院)，山东 泰安 271016

马齿苋(Portulaca oleracea L)为马齿苋科植物马齿苋的全草，是一年生的肉质草本植物，在我国有着悠久的应用历史，其营养价值和药用价值都很高，是我国卫生部规定的78种药食同源野生植物之一。马齿苋性寒，酸，入心、肝、脾、大肠经，具有清热解毒、凉血止血、止痢健胃等功效[1-2]。主要用于防治肠炎、痢疾、痔疮、皮肤感染、急性尿路感染、带状疱疹等症，有“天然抗生素”之美称[3-4]。黄酮类化合物是马齿苋主要有效成分之一, 具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、保护心血管等活性[5-6]。本研究采用Box-Behnken效应面法，以总黄酮提取率为指标对马齿苋中总黄酮的提取工艺中关键因素进行优化，该方法科学、可行，以期为马齿苋中总黄酮的提取提供科学依据。

1 仪器与试剂

UV2550型紫外-可见分光光度计(日本岛津)；FA1204B型电子分析天平(上海佑科仪器仪表有限公司)；RE-52A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；SHB-B95A型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；DZF-6020型真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；FW135型中草药粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)

马齿苋药材采自山东第一医科大学药用植物园,经药学院高红莉教授鉴定为马齿苋科植物马齿苋Portulaca oleracea L.的干燥地上部分。芦丁标准品(≥ 98%，成都埃法生物科技有限公司),水为蒸馏水，其它试剂均为国产分析纯。

2 方法与结果

2.1 供试液的制备

2.1.1对照品溶液的制备 精密称量芦丁标准品10 mg,得浓度为0.2 mg·ml-1的对照品储备液，备用。

2.1.2马齿苋总黄酮的提取 称取干燥后的马齿苋样品粗粉10.00 g，石油醚回流脱脂后按单因素实验和效应曲面设计法试验中不同的提取条件回流提取，将提取液冷却浓缩，用60%乙醇溶解定容至50 ml容量瓶中，作为样品待测液。

2.2 总黄酮的测定

2.2.1标准曲线的制备 精密量取对照品溶液0.5 ml、1.0 ml、2.0 ml、3.0 ml、4.0 ml、5.0 ml，分别用60%乙醇溶液定容至10 ml的容量瓶中,各加入1 ml 5%NaNO2溶液,振摇,放置6 min，加入1 ml10%AL(NO3)3溶液,振摇,再放置6 min，然后各加入4%NaOH溶液1 ml,用60%乙醇定容,振摇,静置15 min，在波长510 nm处测定。以芦丁浓度为横坐标(X),吸光度为纵坐标(Y),做标准曲线,得方程Y=16.105X-0.0046(R2=0.9998)。

2.2.2马齿苋总黄酮含量测定 精密量取1 ml待测液于10 ml容量瓶中，按“2.2.1”项下的操作方法，再计算出样品中总黄酮的含量。

2.3 单因素试验

2.3.1乙醇浓度对马齿苋总黄酮提取率的影响 取马齿苋粗粉5份，每份10.0 g，分别加入10倍量体积乙醇浓度50%、60%、70%、80%和90%的溶液回流提取1 h，按“2.2.1”项下操作，于510 nm处测定，计算出总黄酮的含量，结果见图1。随着乙醇体积浓度的增加马齿苋总黄酮的提取率随之升高,当乙醇浓度为80%时，总黄酮的提取率最高，随后总黄酮提取率开始下降。因此,提取时选择浓度为70%～90%乙醇。

图1 乙醇浓度与提取率的关系

2.3.2提取时间对马齿苋总黄酮提取率的影响 取马齿苋粗粉5份，每份10.0 g，分别加入10倍量的80%乙醇溶液，分别回流0.5、1、1.5、2和2.5 h，按“2.2.1”项下操作，于510 nm处测定，计算出总黄酮的含量，结果见图2。随着回流时间的延长，总黄酮提取率也升高，提取时间到1.5 h时提取率达到最大值，之后，总黄酮的提取率趋于稳定且有所下降，因此，确定回流提取1.5 h。

图2 提取时间与提取率的关系

2.3.3料液比对马齿苋总黄酮提取率的影响 取马齿苋粗粉5份，每份10.0 g，分别用10、15、20、25、30倍体积的80%乙醇溶液，回流1 h，按“2.2.1”项下操作，于510 nm处测定，计算出总黄酮的含量，结果见图3。随着料液比的加大，总黄酮的提取率逐渐升高，当溶剂达到一定量之后，总黄酮提取率趋于稳定，由于加大溶剂的量，会提高提取的成本，故料液比选择15～25倍。

图3 料液比与提取率的关系

2.3.4提取温度对马齿苋总黄酮提取率的影响 取马齿苋粗粉5份，每份10.0 g，分别加入10倍量的80%乙醇溶液，在50℃、60℃、70℃、80℃和90℃回流提取1 h，按“2.2.1”项下操作，于510 nm处测定，计算出总黄酮的含量，结果见图4。温度与总黄酮的提取率有显著的相关性，温度80℃时总黄酮提取率最高。故回流提取温度选择70～90℃。

图4 提取温度与提取率的关系

2.4 工艺优化试验

2.4.1实验设计与结果 根据相关文献资料及单因素实验结果[7-8]，选取影响提取工艺的主要因素料液比(A)、提取温度(B)、乙醇浓度(C)作为考察因素，以总黄酮提取率为效应值，进行星点设计-效应面法。试验水平因素安排见表1，设计方案及结果见表2。

2.4.2模型拟合 采用Design Expert软件对表2的结果进行分析，以马齿苋中总黄酮提取率为效应值，经回归拟合后，得到回归模型方程为:Y=-10.51998+0.020100A+0.16325B+0.13815C+1.4960AB+1.9960 AC+4.74600BC-1.03700 A2-1.28470 B2-1.20997 C2。见表3。

表1 因素与水平

表2 设计方案及结果

表3 方差分析结果

由表3结果可知，实验所得的回归模型方程极显著(p<0.0001)，在本实验设定的区域范围内，乙醇浓度和回流提取温度的P值均<0.0001，对总黄酮得率的影响极显著。料液比二次项P<0.05，整体模型P值小于0.0001达到极显著水平，失拟项不显著，说明该模型拟合性较好。

2.4.3效应面优化和预测 根据回归模型方程，将料液比、提取温度和乙醇浓度对马齿苋总黄酮提取率的影响绘制成响应面图5。由图5可知，回流提取温度对总黄酮提取率的影响最显著，其次是乙醇浓度，料液比对总黄酮提取率的影响最小。根据模型分析结果及相应的响应面图，确定马齿苋总黄酮回流提取的最佳工艺条件：料液比1∶22.7，提取温度78℃，乙醇浓度77.8%。根据实验操作的可行性，将提取工艺修正为：料液比为1∶20(g·ml-1)，提取温度为80℃ ，乙醇浓度为80%。在此条件下，测得总黄酮提取率为1.217%(RSD=1.68%，n=5)，与理论预测值1.251%接近，说明该模型能够较为真实地反映各因素对总黄酮提取率的影响，模型方程可靠，具有一定实用价值。

图5 料液比、提取温度和乙醇浓度对总黄酮提取率的效应面图

3 讨 论

本实验通过单因素分别考察了料液比、提取温度、提取时间和乙醇浓度对马齿苋总黄酮提取率的影响，确定了影响提取率的主要因素。由于Box-Behnken效应面法是采用非线性数学模型拟合，并在中心点进行重复性试验，可以提高试验的精确度，能够更好的体现各因素与效应值的关系[9]，故本实验采用Box-Behnken效应面法设计试验，建立了回归模型，并通过方差分析，得出各个因素之间的交互作用都很强，确定影响马齿苋总黄酮提取率的因素主次关系依次为提取温度>乙醇浓度>料液比。此模型能较好地预测马齿苋提取的总黄酮得率，对将Box-Behnken效应面法用于马齿苋中总黄酮提取工艺的产业化具有一定的指导意义。