基质分散固相萃取-QuEChERS耦合HPLC法测定棉花叶片中吡虫啉及其相关代谢物

节梦蕾，时英爽，高有华，韩 瑶，袁 震，景伟文

(1.新疆农业大学化学工程学院, 新疆 乌鲁木齐 830052；2.新疆农业大学农学院, 新疆 乌鲁木齐 830052)

棉花是我国重要的经济作物之一，新疆是我国棉花的主产区。棉花的种植过程中每年都要大量使用吡虫啉农药来防治虫害[1]。吡虫啉(1-(6-氯-3-吡啶甲基)-N-硝基咪唑-2-亚胺，imidacloprid，IMI)是新烟碱类杀虫剂的第1个成员。该杀虫剂通过破坏昆虫中枢神经系统中的烟碱乙酰胆碱受体起作用，应用较为广泛[2-4]。吡虫啉属于内吸性农药，当用于农作物时，杀虫剂到达植物的内部并转化为多种代谢物。吡虫啉降解产生的几种代谢物中，一些具有生物活性的代谢物在很大程度上被植物保留。这些代谢物因其比农药母体具有更强的生态毒性和环境稳定性，对环境和人类健康的危害甚至远高于农药母体[5-7]。因此，研究棉花叶片中吡虫啉及其代谢物对科学合理使用农药、提高农产品品质以及全面评价其环境影响都有着重要的意义。目前大多数分析研究主要集中在母体化合物上，有关其代谢物的研究非常有限[8-9]。

吡虫啉在不同介质中的代谢途径主要通过以下4种方式来进行：(1)经反硝化作用直接产生吡虫啉胍，然后进一步氧化为吡虫啉脲；(2)吡虫啉中的硝基被还原成为亚硝基衍生物，亚硝基进一步被还原成为吡虫啉胍；(3)咪唑环被氧化形成4,5-二羟基吡虫啉，然后脱水形成烯式吡虫啉；(4)再经水解形成6-氯烟酸(6-CNA)，并与介质中共存的小分子(氨基酸，麦芽糖，葡萄糖，丁二酸等)形成不同的结合物 。

建立吡虫啉及其代谢物含量的测定方法是进行相关研究的前提条件。农药测定的主要步骤包括样品预处理和仪器分析[10-11]。QuEChERS前处理方法由美国农业部Anastassiadas M等[11]于2003年提出，是当前在农药残留提取上使用最为普遍的前处理技术之一，得名于其快捷、简易、廉价、有效、可信、安全的特征。由于方法本身具有模板的性质，为适应不同基质和分析物的测定要求，需不断进行尝试和改进。而与叶类蔬菜食品相比，作物叶片中富含大量的酚类、酯类和色素类物质，因此基于测定基质的不同特点，要求前处理方法有一定的适应性，但目前大量的研究结果集中在食品方面[12-14]。另外，目前主要采用高效液相色谱质谱联用技术(HPLC-MS)对吡虫啉代谢产物进行测定。王建华等[15]利用HPLC-MS/MS技术建立的分析方法回收率为71.9%～117.8%，相对标准偏差(RSD)为0.8%～9.6%，定量限(LOQ)为0.2～1.0 μg·kg-1。Polat等[16]利用LC-MS/MS技术建立的分析方法回收率为107.12%，RSD为17.96%。Xu等[17]利用UPLC-MS/MS技术建立的分析方法回收率为60.5%～114.6%，RSD<20%，LOQ为0.1～17.3 μg·kg-1。Seo等[18]利用HPLC-MS技术建立的分析方法RSD≤20%，回收率为70%～120%，检出限(LOD)达到5～10 μg·g-1。虽然上述研究所建立的分析方法完全满足测定要求，但是LC-MS技术仪器投资成本高，操作也比较复杂，目前还未得到广泛运用。HPLC因具有成本低、灵敏度高、基体效应小等优点[19]，仍然是运用最为广泛的农药残留检测方法。因此，建立吡虫啉和代谢物同时测定的色谱方法，不失为现行条件下经济、快速、全面检测农药残留的不二选择。但目前可以借鉴的研究并不多。本研究采用QuEChERS方法耦合HPLC方法测定棉花叶片中的吡虫啉和代谢物，针对测定基质的不同特点对QuEChERS前处理方法中的相关影响因素逐一进行了详细讨论，并探索出适当的HPLC测定条件，最后运用该方法对样品中吡虫啉及其4种代谢物6-氯烟酸、吡虫啉胍、烯式吡虫啉和吡虫啉脲的残留情况进行了定量分析。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂以及溶液的配制

仪器和试剂：LC-20AB高效液相色谱仪(岛津公司，日本)；吡虫啉标准品(100 μg·mL-1，纯度>97%)购自北京坛墨质检科技有限公司。6-氯烟酸标准品(纯度>99%)购自上海阿拉丁试剂有限公司。烯式吡虫啉(纯度>98.7%)、吡虫啉脲(纯度>99.7%)和吡虫啉胍标准品(纯度>83.9%)均购自德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司。QuEChERS方法所用试剂均购自深圳逗点生物技术有限公司。

标准储备液：以流动相溶解后定容，配制成质量浓度分别为10.00、510.00、400.00、570.00 mg·L-1和520.00 mg·L-1的吡虫啉、吡虫啉脲、烯式吡虫啉、吡虫啉胍、6-氯烟酸单标储备液。而后分别准确移取适量上述单标储备液稀释成所需浓度。溶液4℃避光保存。

1.2 大田施药方法和样品材料准备

在新疆乌鲁木齐三坪农场按制剂量47.25 g·hm-2于2018年8月手动喷雾叶面施用吡虫啉粉剂(70%水分散粒剂)。另设清水空白对照，处理间设保护带。小区面积为15 m2,各处理设4个重复，药后定时采样。随机采集棉花叶片1 kg带回实验室内贮于低温冰箱中保存待用。

1.3 测定方法

1.3.1 样品的前处理方法 称取10.00 g打碎后的棉花叶片于50 mL离心管中，加入20.00 mL乙腈，振荡5 min后加入盐析材料，摇匀，振荡5 min后超声3 min，于4 000 r·min-1下离心5 min，取2.00 mL上清液快速加入带有净化剂的离心管中，快速手动振摇后将上清液以0.22 μm有机相微孔滤膜过滤，待测。

1.3.2 色谱检测条件 取20 μL滤液HPLC进样检测，记录峰面积。仪器：SPD-20紫外检测器；色谱柱：ODS-3(4.6 mm×250 mm, i.d., 5 μm)，测定波长：270 nm；洗脱方式：等度洗脱；柱温：30℃；进样量：20 μL。

1.3.3 方法的验证和应用 每个样品平行测定3次，结果取其平均值，方法验证和样品测定具体见文章2.5和2.6小节。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的选择

HPLC中流动相种类会直接影响目标物检测的选择性、灵敏度和分离效果[20]。由于代谢物在结构和极性上相似性较高，因此给分离测定带来一定困难。考察不同流动相的分离结果，发现当采用2%乙腈/甲醇-水作为流动相时，能够得到较好的峰形和较高的分离度且杂质干扰较少，检测效果较好。因此，确定流动相为2%乙腈/甲醇-水，比例3∶7，流速0.7 mL·min-1(参看图4)。

2.2 提取溶剂的选择

提取剂的选择对试验的检测结果有着直接影响。乙腈是适宜范围较宽的常用萃取剂，并且对于含色素较多的样品也显示出理想的提取效果[21]。考虑到提取溶剂pH值对棉花叶片中农药回收率的影响，本文采用乙腈和5%甲酸-乙腈进行对比试验，按上述的分析方法和液相色谱条件对样品进行分析测定。如图1所示，当以乙腈作为提取剂时，所得的吡虫啉及其4种代谢物的回收率较高，并且其相对标准偏差较小，提取效果良好。本实验最终选择乙腈作为提取溶剂。

图1 乙腈和5%甲酸-乙腈的提取效果比较

2.3 盐析材料的选择

QuEChERS前处理方法的盐析材料有两种，第一种是EN方法推荐的无水MgSO4、Na3C6H5O7和C6H6Na2O7，另一种是AOAC方法推荐的无水MgSO4和无水C2H3NaO2[22-23]。在样品提取液中分别添加这两种萃取盐析材料(盐析试剂A：6.00 g MgSO4，1.00 g NaCl，1.50 g C2H3NaO2；B：4.00 g MgSO4，1.00 g NaCl，1.00 g Na3C6H5O7，0.50 g C6H6Na2O7)，结合使用净化材料进行前处理，其他步骤同1.3.1，以回收率考察萃取效果。所得盐析试剂A组合对吡虫啉及其代谢物的回收率为5.00%～108.44%，RSD为0.03%～15.33%。盐析试剂B组合的回收率为54.50%～108.30%，RSD为0.07%～2.08%，其结果偏差小，更稳定，效果好于A。故1.00 g氯化钠、4.00 g无水硫酸镁、0.50 g柠檬酸二钠盐和1.00 g柠檬酸钠为选用的盐析材料。

2.4 净化剂的选择及用量

PSA(N-丙基乙二胺)、C18和GCB(石墨化碳黑)为QuEChERS前处理方法中常用的固相萃取吸附剂。在离心管中依次将C18、PSA、C18+PSA、C18+PSA+GCB这4种组合的净化材料分散加入到样品的萃取液中吸附干扰物，其他前处理步骤不变，同样以回收率检验净化效果，结果如图2所示。由图2可知，综合所有代谢物的回收率来看，PSA能有效地吸附杂质而不影响目标物的测定。同时结合图4发现，PSA能够消除吡虫啉及其代谢物目标峰周围干扰杂质的影响。因此，PSA作为本次试验的净化材料最为适宜。

图2 净化剂的种类对回收率的影响(用量均为50 mg)

吸附剂用量也会对杂质净化产生影响，用量过少，基质去除不完全；用量过多，则分散剂会吸附分析物，影响到回收率，因此需对PSA的使用量进行筛选。分别取10、20、25、30、40、50 mg PSA于离心管中，各加入棉花叶片样品提取液，其余预处理步骤不变，结果如图3所示。由图3可知，当PSA的用量为25 mg时，能得到较好的回收率，效果最佳，因此将25 mg选为适宜用量。

图3 PSA的用量对回收率的影响

2.5 方法学的验证

取10.00 g空白棉花叶片样品，加入不同浓度吡虫啉的混标溶液，采用乙腈作为提取液，试剂A组合作为盐析材料，25 mg PSA作为净化剂，进行加标回收试验。我国NY/T 788—2004《农药残留试验准则》[24]对于检测分析方法的要求是：当添加浓度大于0.01 mg·kg-1时，其合适的回收率应在70.00%～120.00%，相对标准偏差(RSD)应小于10.00%。由表1可知，在不同添加水平下，6-氯烟酸、吡虫啉胍、烯式吡虫啉、吡虫啉脲和吡虫啉的回收率分别为96.47%～109.32%、96.80%～110.90%、92.84%～107.61%、93.86%～105.98%和98.15%～107.73%，RSD分别为0.15%～1.17%、0.72%～1.31%、3.75%～6.99%、0.79%～5.03%和3.21%～5.92%。各指标的具体测定结果见表2。6-氯烟酸、吡虫啉胍、烯式吡虫啉、吡虫啉脲和吡虫啉的LOD分别为0.0066、0.091、0.0011、0.042 mg·kg-1和0.0044 mg·kg-1，LOQ分别为0.028、0.036、0.0059、0.19 mg·kg-1和0.015 mg·kg-1，相关系数在0.9988～0.9998之间。由此表明，该方法能够满足定量分析的基本要求。

表1 样品的加标回收率和相对标准偏差

表2 吡虫啉及其代谢物的检出限、定量限、线性范围和线性方程

2.6 实际样品的测定

以上述建立的方法对样品进行测定(详例如图4)。测定结果显示，喷药后0～7 d，代谢物在棉花叶片中均未检出，吡虫啉的含量为0.53～1.99 mg·kg-1。第10天检出6-氯烟酸，10～15 d的吡虫啉及代谢物6-氯烟酸、吡虫啉胍、烯式吡虫啉、吡虫啉脲的含量分别为0.20～0.23、0.79～2.16、0.09、0.06 mg·kg-1和0.28 mg·kg-1，此时吡虫啉已不是主要的残留物。

注：Ⅰ～Ⅴ依次代表6-氯烟酸，吡虫啉胍，烯式吡虫啉，吡虫啉脲，吡虫啉。Note:Ⅰ～Ⅴ: mean 6-chloronicotinic acid, guanidine-imidacloprid, olefin imidacloprid, imidacloprid urea, imidacloprid, respectively.

3 讨 论

QuEChERS前处理方法采用净化剂的目的是尽量使吡虫啉与样品基质分离，从而减少样品中其他组分对目标物的干扰，采用不同净化材料的效果不同。GCB可有效去除基质中色素[25]，也对某些农药有一定吸附作用[26]，使用GCB作为净化吸附剂时，吡虫啉脲被GCB吸附，导致回收率小于20%。N-丙基乙二胺(PSA)属于固相吸附剂，能够与金属离子反应形成鳌合物以及与羟基形成共价键氢键，主要用于去除糖类、酚类、有机酸，尤其对于有机酸和极性化合物的亲和性比较好，同时对大部分农药吸附能力较弱，因而作为固相萃取物被广泛地用作农药残留检测的净化剂。棉花叶片基质中的主要干扰物为有机酸、多酚、碳水化合物和甾醇等，PSA作为弱阴离子交换吸附剂，通过对上述干扰物进行吸附能够达到较好的净化效果，但PSA对目标物也有一定的吸附作用。确定合适的PSA用量不但能提高吡虫啉及其4种代谢物的净化效果，同时能减少净化剂对棉花叶片样品中检测目标物的损耗，保证回收率。在提取液中加入C18吸附剂能够吸附去除棉花叶片中较少的脂肪类物质，进一步提高对吡虫啉的净化效果。但是C18对代谢物烯式吡虫啉和吡虫啉脲有吸附作用，使得其回收率降低。综合考虑，本试验使用PSA为净化剂，结合适当的色谱分离条件，得到了满意的结果。

根据2002年农药残留联合专家会议(JMPR)报告，以14C标记的吡虫啉对其代谢进行研究，以番茄为例，在温室栽培条件下，对未成熟果实在收获前14 d进行叶面喷施8 mL 0.2%的25%吡虫啉可湿性粉剂(WP)溶液，用水量600 L·hm-2。测定结果为：放射性残留总量(total radioactive residues,TRR)呈减少趋势，从喷施后4 d的1.01 mg·kg-1到7 d和14 d后的0.84、0.85 mg·kg-1以至收后21 d的0.64 mg·kg-1；喷施后21 d，测得5-羟基吡虫啉(0.027 mg·kg-1)占4.2%，烯式吡虫啉(0.007 mg·kg-1)占1.1%。白雪松[27]研究了吡虫啉及6-氯烟酸在玉米中残留和消解动态，结果表明：吡虫啉及其代谢产物6-氯烟酸在玉米植株中消解速率快，2 h后检出6-氯烟酸，0～14 d吡虫啉及6-氯烟酸的含量分别为1.23～0.46、0.04～0.40 mg·kg-1。Akoijam等[28]测定大米中的吡虫啉和代谢产物的含量，其中吡虫啉和代谢物(6-氯烟酸、烯式吡虫啉和吡虫啉脲)的总残留量为4.57 mg·kg-1和13.94 mg·kg-1。Sharma等[29]研究吡虫啉和6-氯烟酸在甘蔗叶片中的含量，发现施药7 d后，其在甘蔗叶片中的含量分别为4.97 mg·kg-1和12.99 mg·kg-1。对比发现，利用本文的分析方法所测结果与文献报道的结果类似但又有所不同，表明吡虫啉及其代谢物在不同基质上检出的时间和所占比例存在明显的差异[30-31]，故而需要在建立分析方法的基础上进行具体场景条件下的测定和研究。

4 结 论

本研究建立了以QuEChERS前处理为基础的棉花叶片中吡虫啉及其4种代谢物——吡虫啉脲、烯式吡虫啉、吡虫啉胍和6-氯烟酸的高效液相色谱(HPLC)分析方法。以QuEChERS前处理方法为基础，考察了方法的提取溶剂、盐析材料和净化剂种类及用量的影响。以有效去除基质中杂质干扰为前提，采用HPLC对样品进行定量分析，验证了方法的性能参数，结果表明本方法是一种简单、快捷、可靠的检测方法。