miR-1256靶向调控HERC4影响肝癌细胞的增殖和凋亡

蒋鹏，苏树英，费凛，许卓明，蔡云峰

肝癌发病率呈增长趋势，严重威胁居民生命健康[1]。因肝癌发病较为隐匿，早期缺乏特异性临床症状，多数患者预后较差，5年生存率较低[2-3]。目前，肝癌发病机制尚未完全明确，且缺乏有效的治疗方法。因此，探讨肝癌发生、发展的分子机制并寻找有效的早期肝癌诊治靶标具有重要意义。微小RNA(miRNA)是一类参与调控细胞的增殖、分化、凋亡等生命过程的小分子非编码RNA，与人类肿瘤的发生发展密切相关[4-6]。研究显示，miR-1256在甲状腺乳头状癌组织中表达降低，上调其表达可靶向抑制HTR3A减弱甲状腺乳头状癌细胞的增殖能力，并阻滞细胞周期进程，是该肿瘤治疗的潜在分子靶标[7]；结肠癌组织中miR-1256表达显著降低，且miR-1256低表达与患者TNM分期和淋巴结转移密切，miR-1256高表达的患者总生存期和无病生存期明显高于低表达患者，miR-1256低表达可能是预测结肠癌患者预后不良的独立因素[8]；miR-1256可靶向抑制USP5及β-catenin/ c-Myc信号通路降低胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭性，与肿瘤的发生发展密切相关[7-9]。但miR-1256在肝癌细胞中表达及其对肝癌细胞生物学行为的影响目前尚不明确。本研究主要探讨miR-1256对肝癌细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制，以期为肝癌的靶向分子治疗提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞和试剂

正常肝细胞THLE-2及肝癌细胞MHCC97H、Huh7和MHCCLM3，中国科学院上海细胞库；胎牛血清(FBS)和RPMI 1640培养基，美国Gibico公司；噻唑蓝(MTT)和胰蛋白酶，美国Sigma公司；兔抗人HERC4抗体(货号A-AP21313c)，武汉艾美捷科技有限公司；鼠抗人Cyclin D1(货号sc-8396)、p21(货号sc-6246)、Bcl-2(货号sc-7382)、Bax(货号sc-7480)单克隆抗体，美国Santa Cruz公司；LiPofectamineTM2000试剂盒，美国Invitrogen公司；Trizol试剂、逆转录试剂盒和PCR试剂盒，深圳晶美生物工程有限公司；miR-1256模拟物mimcs、抑制剂和HERC4过表达载体及对照，上海吉玛制药技术有限公司；Annexin V-FITC/PI试剂盒，艾美捷科技有限公司；双荧光素酶活性检测试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 复苏正常肝细胞THLE-2及肝癌细胞MHCC97H、Huh7和MHCCLM3，加含10% FBS的RPMI 1640培养基培养。将对数生长期的各细胞接种于24 孔板中(1×105个/孔)，培养24 h后，0.25 %胰蛋白酶消化，收集细胞。qRT-PCR法检测细胞中miR-1256与HERC4 mRNA的表达，Western blot法检测HERC4蛋白表达。选择miR-1256、HERC4表达与THLE-2细胞差异最显著的肝癌细胞进行后续实验。

1.2.2 细胞转染 将MHCC97H细胞接种于6孔板中(1×105个/孔)，用LiPofectamineTM2000脂质体法，分别转染miR-1256 mimcs(miR-1256组)、miR-NC(miR-NC组)、anti-miR-1256(anti-miR-1256组)、anti-miR-NC(anti-miR-NC组)、si-HERC4(si-HERC4组)、si-NC(si-NC组)、共转染miR-1256 mimcs与 pcDNA-HERC4(miR-1256+pcDNA-HERC4组)、miR-1256 mimcs与pcDNA(miR-1256+pcDNA组)，转染时间为6 h。更换培养基，再培养24 h，qRT-PCR检测细胞中miR-1256表达或Western blot法检测HERC4蛋白表达验证转染效果，并收集细胞用于后续实验。

1.2.3 双荧光素酶报告基因实验 PCR扩增含miR-1256结合位点的HERC4的3′UTR序列，构建HERC4野生型质粒(WT-HERC4)和突变型质粒(MUT-HERC4)。将MHCC97H细胞接种于6孔板中(1×105个/孔)，用LiPofectamineTM2000脂质体法，分别共转染WT-HERC4与miR-1256 mimic或miR-NC、MUT-HERC4与miR-1256 mimic或miR-NC，转染时间为6 h。更换培养基。再培养24 h，收集细胞并裂解，利用双荧光素酶活性检测试剂盒检测荧光素酶活性。

1.2.4 MTT检测细胞增殖 转染后的各组MHCC97H细胞以接种于96孔板中(1×103个/孔)，分别培养24 h、48 h、72 h。加20 μL MTT(5 g/L)，孵育4 h后，弃培养基。加150 μL二甲基亚砜，振荡混匀，酶标仪490 nm测OD值。每组设3个复孔，实验重复3次。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 转染后的各组MHCC97H细胞接种于24孔板中(1×104个/孔)。培养48 h后，收集细胞。利用Annexin V-FITC/PI试剂盒，采用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.6 qRT-PCR检测miR-1256和HERC4 mRNA表达 Trizol试剂提取各组细胞中总RNA，逆转录为cDNA后，行PCR扩增。PCR扩增条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环。引物序列：miR-1256上游：5′-GGCGCGATTTTAGTTTATC-3′，下游：5′-TTTAATTACCAACCG-AATACG-3′；U6上游：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGG-3′，下游：5′-GTGCTCGCTTCGGCAGC-3′；HERC4上游：5′-TGATAGATG-GGGGATTGTCG-3′，下游：5′-ACCCAGTGATTGGTGGCTCAT-3′；GAPDH上游：5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′，下游：5′-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3′。2-ΔΔCt法计算miR-1256相对于U6、HERC4 mRNA相对于GAPDH的表达水平。

1.2.7 Western blot法检测HERC4、CyclinD1、p21、Bcl-2和Bax蛋白表达 RIPA试剂提取各组细胞中总蛋白，BCA法检测蛋白含量后，以每泳道20 μg蛋白行SDS-PAGE电泳。电泳后，湿转至PVDF膜，并于5%脱脂奶粉溶液中封闭1 h。分别加HERC4(1 ∶500)、CyclinD1(1 ∶500)、p21(1 ∶500)、Bcl-2(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶1 000)和GAPDH(1 ∶1 000)一抗，4 ℃孵育过夜。再加山羊抗兔二抗IgG(1 ∶3 000)，37 ℃孵育1 h。加显影液避光显影，曝光拍照，Image J软件分析目的蛋白相对GAPDH的表达水平。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 miR-1256和HERC4在肝癌细胞中的表达

如图1、表1所示，肝癌细胞系MHCC97H、Huh7和MHCCLM3中miR-1256的表达低于正常肝细胞THLE-2(P<0.05)，而HERC4 mRNA及蛋白表达均高于THLE-2细胞(P<0.05)。选择miR-1256、HERC4表达与THLE-2细胞差异最显著的MHCC97H细胞进行后续实验。

图1 肝癌细胞系中HERC4蛋白表达

表1 miR-1256和HERC4在肝癌细胞系中的表达

2.2 miR-1256靶向调控HERC4表达

如图2A所示，HERC4的3′UTR中含有与miR-1256互补的核苷酸序列。双荧光素酶报告基因实验检测结果显示，与共转染WT-HERC4与miR-NC的细胞比较，共转染WT-HERC4与miR-1256 mimics的细胞荧光素酶活性降低[(0.39±0.03)vs(1.04±0.09)，t=20.555，P<0.01]；而与共转染MUT-HERC4与miR-NC的细胞比较，共转染MUT-HERC4与miR-1256 mimics的细胞荧光素酶活性无差异差异[(1.03±0.09)vs(1.02±0.08)，t=0.249，P=0.806]，表明miR-1256可与HERC4的3′UTR结合。如图2B所示，miR-1256组HERC4蛋白水平显著低于miR-NC组[(0.21±0.03)vs(0.63±0.06)，t=18.783，P<0.01]，anti-miR-1256组HERC4蛋白水平显著高于anti-miR-NC组[(0.99±0.09)vs(0.62±0.05)，t=10.781，P<0.01]，进一步说明miR-1256负调控HERC4表达。

2.3 过表达miR-1256对MHCC97H细胞增殖和凋亡的影响

如图3和表2所示，与miR-NC组比较，miR-1256组MHCC97H细胞中miR-1256水平升高(P<0.05)，细胞培养48、72 h后的OD490 nm值(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)，与增殖和凋亡相关的蛋白CyclinD1、Bcl-2表达降低(P<0.05)，而p21、Bax表达升高(P<0.05)。

图2 miR-1256靶向调控HERC4的表达 A： HERC4的3′UTR中含有与miR-1256互补的核苷酸序列；B： miR-1256对HERC4蛋白表达的影响

图3 过表达miR-1256对MHCC97H细胞增殖和凋亡的影响 A：miR-1256过表达后MHCC97H细胞中增殖、凋亡相关蛋白表达条带；B：miR-1256过表达后MHCC97H细胞凋亡流式图

表2 过表达miR-1256对MHCC97H细胞增殖和凋亡的影响

2.4 抑制HERC4对MHCC97H细胞增殖和凋亡的影响

如图4和表3所示，与si-NC组比较，si-HERC4组MHCC97H细胞中HERC4蛋白表达降低(P<0.05)，细胞培养48、72 h后的OD490 nm值降低(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)，与增殖和凋亡相关的蛋白CyclinD1、Bcl-2表达降低(P<0.05)，而p21、Bax表达升高(P<0.05)。

表3 抑制HERC4对MHCC97H细胞增殖和凋亡的影响

图4 抑制HERC4后MHCC97H细胞中增殖、凋亡相关蛋白表达

2.5 过表达HERC4逆转过表达miR-1256对MHCC97H细胞增殖和凋亡的作用

如图5和表4所示，与miR-1256+pcDNA组比较，miR-1256+pcDNA-HERC4组MHCC97H细胞中HERC4蛋白表达升高，细胞培养48、72 h后的OD490 nm值升高(P<0.05)，凋亡率降低(P<0.05)，与增殖和凋亡相关的蛋白CyclinD1、Bcl-2表达升高(P<0.05)，而p21、Bax表达降低(P<0.05)。

图5 同时过表达miR-1256和HERC4后MHCC97H细胞中增殖、凋亡相关蛋白表达

表4 过表达HERC4逆转过表达miR-1256对MHCC97H细胞增殖和凋亡的作用

3 讨论

miRNA可靶向其靶基因的表达，参与调控细胞增殖、分化和凋亡等生命活动[10-11]。正常机体内，miRNA的表达具有严格的组织及时序特异性[12]，当miRNA表达异常时可导致肿瘤等疾病的发生和发展[13-15]。研究显示，miR-1256通过靶向下调构造蛋白家族成员1(TCTN1)的表达抑制非小细胞肺癌(NSCLC)的增殖和迁移，miR-1256/TCTN1轴可作为NSCLC的治疗靶标[16]。但目前，miR-1256对肝癌细胞恶性表型的影响和机制还未知。

为了探究miR-1256对肝癌细胞恶性表型的影响，本研究首先检测了miR-1256在肝癌细胞系中的表达，结果表明，miR-1256在肝癌细胞系中的表达明显低于正常肝细胞，提示miR-1256可能参与调控肝癌细胞恶性表型；而过表达miR-1256后，肝癌细胞OD值和CyclinD1蛋白表达降低，而p21蛋白表达升高，表明过表达miR-1256抑制了肝癌细胞增殖；同时，过表达miR-1256提高了肝癌细胞凋亡率及Bax蛋白表达，而抑制了Bcl-2蛋白表达，说明过表达miR-1256可促进肝癌细胞凋亡。这提示miR-1256在肝癌中发挥抑癌基因作用，可能是肝癌治疗的潜在分子靶点。

泛素-蛋白酶体系在肿瘤发生和发展过程中发挥关键作用。E3泛素连接酶因具有底物识别特异性在泛素-蛋白酶体系占据重要位置[17]。HERC4是近年来发现的E3泛素连接酶，参与肺癌、宫颈癌、乳腺癌、肝癌等肿瘤的发生和发展[18-20]。本研究显示，肝癌细胞中HERC4 mRNA和蛋白表达升高，抑制HERC4表达抑制了肝癌细胞的增殖，并诱导其凋亡，与Zheng等[21]报道的下调HERC4表达抑制肝癌细胞的增殖，促进凋亡这一结果一致，说明HERC4促进肝癌的发生和发展。本研究利用双荧光素酶报告基因实验及检测miR-1256对HERC4蛋白表达的影响证实了miR-1256靶向负调控HERC4表达。本研究还显示，过表达HERC4减弱过表达miR-1256对肝癌细胞增殖的抑制作用及凋亡促进作用，提示miR-1256可能通过下调HERC4表达来影响肝癌细胞增殖和凋亡。

综上，肝癌细胞系中miR-1256表达降低，而HERC4表达升高；过表达miR-1256可降低肝癌细胞的增殖能力且加剧肝癌细胞凋亡，其作用机制可能为靶向抑制HERC4表达有关，miR-1256/HERC4轴可能为肝癌的靶向分子治疗提供了新的分子靶点。