阿米洛利类化合物对alpha2肾上腺素受体亲和力的研究

文/张萧萧，刘丽艳，黄宁，陈军利（四川大学华西基础医学与法医学院病理生理学教研室）

α2 肾上腺素受体（α2-adrenergic receptor, α2-AR）是GPCR 超家族的一种膜蛋白，是内源性儿茶酚胺的受体，该受体有三种亚型，分别是α2A、α2B 和α2C[1-2]。α2-AR 可调节多种生理病理过程的发生发展，例如痛觉[3]、抑郁症[4-5]、青光眼[6]、肝纤维化[7]等。因此，α2-AR 可能是治疗上述疾病的重要靶点之一。多种以α2-AR 为靶点的药物已经上市并运用与临床，如右旋美托咪定[5]、替托尼定[8]等。然而，目前以α2-AR为靶点的药物存在许多问题，如对各亚型的选择性差、副作用大等。因此，继续研究新型以α2-AR 为靶点的药物迫在眉睫。

近年来多项研究表明，别构调节剂具有副作用小、选择性高、耐药率低且不影响受体生理功能等作用[9-10]。目前已有文献报道过阿米洛利类化合物对α2-AR 具有别构调节作用[11]，但对α2B 和2C 的亲和力及选择性尚未见报道。本文检测阿米洛利及Benzamil 对2B 和2C 的亲和力，以探讨这两种化合物是否对α2-AR 受体亚型具有选择性，为研发新型α2-AR 亚型选择性药物打下结构基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

COS-7 细胞（ATCC），PEI 40000（polysciences），PBS（HyClone），DMEM高糖培养基（HyClone），青霉素- 链霉素溶液（BioSharp），FBS（GIBCO），BCA 试剂盒（碧云天），3H-RX821002（PerkinElmer），酚妥拉明（Sigma），阿米洛利（MCE），Benzamil（MCE），15cm细胞培养皿（NEST）。

1.2 质粒瞬时转染及膜蛋白提取

将1×107个COS-7 细胞接种于20ml含有FBS 和双抗的DMEM 高糖培养基的15cm 培养皿中，在含5% CO2的细胞培养箱中37℃培养过夜。转染前1 小时，将培养液换为不含FBS 和双抗的高糖DMEM 培养基。将质离DNA 与PEI40000 按1:3 混合，室温静置15 分钟加入细胞培养皿中，在含5% CO2的细胞培养箱中37℃培养4-6 小时，将培养液换为含FBS 和双抗的DMEM高糖培养基，48-72 小时后，提取膜蛋白。用10ml 4℃ PBS清洗细胞两次，收集细胞于50ml 离心管中，离心（4℃，800g）5分钟。用20ml HEPES 缓冲液重悬细胞，匀浆机24000r/min匀浆10秒，重复3次，每次间隔30秒。将重悬物离心（4℃，1300g）10分钟，取上清离心（4℃，100000g）1小时，弃上清。用含10%甘油的HEM 缓冲液重悬沉淀，用1ml胰岛素注射器反复吹打均匀，每管50μl 分装，-80℃保存。BCA法检测蛋白浓度。

1.3 受体表达实验

将不同浓度含有目的蛋白（α2B 或α2C）的膜蛋白与2nM 的3H-RX821002室温共孵育1 小时，非特异性结合为在100μM 酚妥拉明存在下的结合。加入4℃PBS 终止反应，通过GF／B 滤膜过滤，最后用液体闪烁仪测定放射性。

1.4 竞争性结合实验

将浓度依次增加（10-3M-10-10M）的阿米洛利或Benzamil 加入到含有α2B 或α2C-AR 的膜蛋白以及3.5nM 3H-RX821002 的HEM 缓冲液中，终体积为200μl，非特异性结合为100μM酚妥拉明存在下的结合。室温孵育1 小时，加入4 ℃ PBS 终止反应，GF ／ B滤膜过滤，通过液体闪烁仪对样品放射性进行测定。

图1 α2B-AR（A）和α2C-AR（B）表达实验A、B：Amiloride和Benzamil对α2B-AR的亲和力；C、D：Amiloride和Benzamil对α2C-AR的亲和力

图2 阿米洛利类化合物对α2-AR的亲和力检测

2 结果

2.1 α2B-和α2C-AR 表达量检测

通过表达实验对每次所提取的膜蛋白的目的蛋白（α2B 或α2C-AR）进行活性及表达水平检测。如图1A、1B 所示，配体受体总结合量随着加入的膜蛋白量的增加而增加，非特异性结合变化不明显，表明目的蛋白（α2B 或α2C-AR）表达量较高。对于α2B-AR（图1A），我们选用4-8μg进行后续的配体受体竞争性结合实验；对于α2C-AR（图1B），我们选取6-8μg 进行后续的竞争性结合实验。

2.2 阿米洛利类化合物与α2B-和α2CAR 亲和力检测

我们通过配体受体竞争性结合实验检测了阿米洛利和Benzamil 对α2B-AR 和α2C-AR 的亲和力。如图2 所示，阿米洛利对α2B-AR 和α2C-AR 的IC50 分别为30.73μM 和45.59μM；Benzamil 对α2B-AR 的IC50 为1.925μM， 对α2CAR 的IC50 为0.322μM，说明Benzamil 对α2C-AR 的亲和力是α2B-AR 的6 倍，对α2C-AR 具有选择性。

3 讨论

α2-AR 是GPCR 超家族中的一种膜蛋白受体，有α2A、α2B 和α2C 三种受体类型参与了多种生理病理过程，例如痛觉、抑郁症等。之前的文献报道过阿米洛利类化合物对α2-AR 有别构调节作用，但是它们对α2B-AR 以及α2C-AC 的亲和力以及选择性尚未见报道，因此本文进行了阿米洛利类化合物对其亲和力的检测。

我们发现Benzamil 对这两个亚型的亲和力均大于阿米洛利，且Benzamil 对不同受体类型的亲和力也不同，即对α2CAR 的亲和力是α2B-AR 的6 倍，可知，Benzamil 对α2C-AR 具有受体选择性。该结果为研发新型α2C-AR 选择性药物打下一定的结构基础。