外源高表达miR-133b抑制骨肉瘤的生长与诱导凋亡

陈鹏业 孙建伟 陆丽峰(通信作者)

266400山东省青岛市西海岸新区第二人民医院，山东青岛

骨肉瘤是儿童和青少年中最常见的原发性骨肿瘤类型，常起源于长骨干骺端，占儿科患者所有恶性肿瘤的2.4%。以往骨肉瘤最常见的治疗方法是截肢，近年来由于诊断方法和治疗技术的广泛进步，骨肉瘤患者5年生存率已达60%～70%。尽管许多骨肉瘤患者最初对化疗有反应，但发生转移或复发患者的生存结果极差。因此，迫切需要确定骨肉瘤发展和进展的分子机制，以优化治疗选择。miRNA 是一类长度为21～23 个核苷酸的小RNA 分子，通过与相应mRNA 的3'非翻译区(UTR)结合而负向调节其靶基因的表达。以往的研究报道，miRNAs可以作为致癌基因或肿瘤抑制因子骨肉瘤的发展和转移[1]。有证据表明，miR-133b 在肌肉组织中特异性表达，在肌肉发育、心肌分化和心肌肥厚中起重要作用。研究还表明，miR-133b 在胃癌、结肠直肠癌、膀胱癌、前列腺癌和肺癌等多种癌症中显著下调[2]。miR-133b 靶向表皮生长因子受体(EGFR)，且外源高表达miR-133b能抑制前列腺癌细胞系中的细胞增殖、迁移和侵袭[3]。然而，miR-133b 在骨肉瘤的表达及临床意义尚不清楚。

资料与方法

主要材料：人骨肉瘤MG-63 细胞，购置于美国ATCC 公司；Lipofectamine 2000、miR-133b mimics、scramble、MTT粉购于美国Invitrogen公司。

MTT 实验：培养人骨肉瘤MG-63 细胞，将miR-133b mimics 与scramble 质粒按转染说明分别转染于人骨肉瘤MG-63细胞中。细胞分为miR-133b mimics组与scramble组。分别取上述两组转染后的人骨肉瘤MG-63细胞接种于96孔板中，每组设5 个复孔，培养至临近饱和，每孔加灭菌MTT 液(5 mg/mL)20 μL，孵育4 h后取出，每孔中加入DMSO 150 μL，低速振荡10 min，选择570 nm 波长在酶标仪上测定各孔吸光值，记录结果，实验重复3次。

凋亡实验：采用AnnexinV-FITC/PI染色法检测细胞凋亡。细胞分组与MTT实验相同，收集各组培养至80%密度左右的细胞，用胰酶将细胞消化，再用预冷的PBS液洗涤细胞2次，取约1×106个细胞，加入300 μL 的1×Binding Buffer重悬细胞，再加5 μL AnnexinV-FITC 轻轻混匀，室温避光孵育15 min 后，加入1 μL PI 混匀，再补 加200 μL的1×Binding Buffer后上机，流式细胞仪检测。

统计学处理：数据应用SPSS 16.0 软件处理；计数资料以[n(%)]表示，采用χ2检验；计量资料以(±s)表示，采用t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

外源高表达miR-133b 对人骨肉瘤MG-63 细胞增殖影响：MTT 实验结果显示，在人骨肉瘤MG-63 细胞中，miR-133b mimics 组OD 值为(0.451 ±0.008)，与scramble 组的(0.637±0.013)相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。提示在人骨肉瘤MG-63细胞高表达miR-133b能抑制癌细胞的增殖。

外源高表达miR-133b 对人骨肉瘤MG-63 细胞凋亡影响：凋亡实验结果显示，在人骨肉瘤MG-63 细胞中，miR-133b mimics 组细胞凋亡率为(14.68±0.41)%，与scramble组的(6.154±0.26)%相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。提示在人骨肉瘤MG-63 细胞高表达miR-133b能诱导癌细胞发生凋亡。

讨 论

微小RNA(miRs)是在不同物种中发现的内源性短链非编码RNA分子(含有约22个核苷酸)，其通过与mRNA的特定序列不完全互补而起到降解和翻译抑制的作用。以这种方式，单个miRs可以调节大量独立的靶基因并涉及多种生理和生物化学过程，包括多种细胞信号传导和代谢途径及基本细胞增殖、分化和凋亡。此外，异常miRs表达是一个重要生物学标志，包括癌症在内的多种疾病。一些miRs对疾病进展具有重大影响，并且已被广泛研究和证实。 例如miR-133b，miR-133b 属于经典肌肉特异性microRNAs 家族(miR-1、-133 和-206 s)，最初被认为是肌肉特导性，特别是在心脏和骨骼肌中高度富集，并且是肌肉发育和重塑的关键调节因子[4]。但是现在越来越多的研究表明，miR-133b 在各种人类癌症中呈现异常表达，可能与肿瘤的发生发展密切相关。

大量研究证实，miR-133b 在多种恶性肿瘤中表达下调，如尿路上皮癌、膀胱、胃癌等。这些研究表明，miR-133b的下调是独立因素，与患者的侵袭性临床病理特征、肿瘤亚型和较差的存活率显著相关。 同样有研究还显示，miR-133b 的低表达与结直肠癌患者不良预后生存和转移明显相关[5]。这些结果均表明这些miRNA 具有预测术后临床结果的潜在价值。miR-1 和miR-133b 在复发的前列腺癌标本中显著下调，可作为预测前列腺癌进展的新型生物标志物[6]。血清和分泌物是另一个重要临床标本，循环血清miR-133b可被确定为乳腺癌、胃癌中最重要的诊断和预后标志物。在前列腺癌患者的前列腺分泌物中亦显著下调，可作为诊断标志物[7]。

为评估miR-133b对骨肉瘤细胞生长与凋亡影响，我们首先通过转染miR-133b mimics 来外源高表达人骨肉瘤MG-63 细胞中miR-133b 的表达。通过MTT 实验发现在人骨肉瘤MG-63 细胞中高表达miR-133b后，细胞增殖能力明显减弱。凋亡实验结果显示在人骨肉瘤MG-63细胞中高表达miR-133b后，细胞凋亡率明显增加。这些结果为miR-133b参与骨肉瘤发生发展的可能分子机制提供一个新的思路，miR-133b 也有望成为骨肉瘤患者的潜在治疗靶点。