敲低乳酸脱氢酶A抑制人乳腺癌细胞生长与侵袭

陆丽峰 周雷升 韩明宏 陈鹏业(通信作者)

266400山东省青岛市西海岸新区第二人民医院，山东青岛

乳腺癌是全世界女性最常见的恶性疾病之一。研究报道，2015年美国有234 190例新发病和40 730例死亡。作为一种异质性疾病，乳腺癌根据其分子亚型分为不同类型，为确定适当的综合治疗和预后提供有效方法。以往对乳腺癌研究方面做出突出贡献，包括早期检测和更有效的治疗方法，从而使乳腺癌患者死亡率显著下降，也有效改善乳腺癌患者预后。然而，大多数患者预后仍然较差。因此，必须开发一种新的治疗策略，以便于更有效治疗乳腺癌。能量代谢的改变在癌细胞中很常见，并且被认为是癌症的标志[1]。癌基因诱导的代谢重编程能促进癌细胞生长和增殖。乳酸脱氢酶A(LDHA)是一种糖酵解酶，对癌症能量代谢至关重要，在多种癌细胞中高表达，并与生存率低有关。抑制LDHA的表达能抑制癌细胞的增殖[2]。然而，LDHA在乳腺癌中的表达和功能尚不清楚。

资料与方法

主要材料：人正常乳腺细胞系(MCF-10A)、人乳腺癌细胞系(MDA-MB-231和HCC38)购置于美国ATCC公司。 Lipofectamine 2000、 si-LDHA、si-control、MTT粉、Transwell小室均购于美国Invitrogen公司。

qRT-PCR 检测LDHA 的表达：用RNA 抽提试剂盒抽提MCF-10A、MDA-MB-231 和HCC38 三种细胞中的总RNA，再经逆转录试剂盒合成cDNA，存于-70℃。PCR 扩增反应体系包括2×QuantiTect SYBR Green PCRMaster Mi×10 μL，10×miScript Universal Primer 2 μL，10×miScript Primer Assay 2 μL，Template cDNA 1 μ g，RNase-free water加至共20 μL。循环体系为：①Cycle 1：37℃15 min，3个循环；②Cycle 2：94℃5 s，55℃5 s，70℃5 s，40 个循环；③Cycle 3：4℃5 s，在CFX96 实时荧光PCR 系统上检测。以β-actin 为内参，所测定LDHA 的相对表达量采用2-ΔΔCT法分析。

MTT实验：培养乳腺癌MDA-MB-231细胞，将si-LDHA 与si-control 质粒按转染说明分别转染于MDA-MB-231细胞中。细胞分为si-LDHA组与si-control组。分别取上述两组转染后的MDA-MB-231 细胞接种于96孔板中，每组设5个复孔，培养至临近饱和，每孔加灭菌MTT液(5 mg/mL)20 μL，孵育4 h 后取出，每孔中加入DMSO 150 μL，低速振荡10 min，选择570 nm波长在酶标仪上测定各孔吸光值，记录结果，实验重复3次。

Transwell 侵袭实验：细胞培养与分组同MTT 实验。在transwell 小室中铺加8 μL 稀释好的基质胶，过夜形成基质膜。取100 μL 即含1×105个细胞/mL 的细胞稀释液，接种于transwell 小室上层，下腔加500 μL含20%的FBS培养液后，置于37℃温箱中孵育36 h，取出，用棉签擦弃小室上层未迁移细胞，PBS液轻洗，4%多聚甲醛固定、结晶紫染色下层穿出细胞，PBS 液洗，倒置，晾干。光学显微镜下观察并摄相，随机选取4 个高倍视野进行细胞计数，取平均值，实验重复3次。

统计学处理：数据应用SPSS 16.0 软件处理；计量资料以(±s)表示，采用t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

人乳腺癌细胞中PDL1 表达水平检测：qRT-PCR 检测结果显示，人乳腺癌细胞系(MDA-MB-231 和HCC38)中PDL1的表达水平(7.413±0.216 和6.025±0.157)与人正常乳腺细胞系(MCF-10A)的表达水平(0.866±0.074)比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。

敲低LDHA 对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响：MTT 结果显示，在人乳腺癌MDA-MB-231 细胞中，转染si-LDHA组的OD值为(0.486±0.006)，与si-control 组的(0.715±0.014)相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。提示在人乳腺癌MDA-MB-231 细胞干扰LDHA 后能抑制癌细胞的增殖。

敲低LDHA 对人乳腺癌MDA-MB-231 细胞侵袭的影响：Transwell 结果显示，si-LDHA 组穿过基质胶的人乳腺癌MDA-MB-231 细胞数量为(136±11)，与si-control 组的(214±18)相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。提示在人乳腺癌MDA-MB-231 细胞干扰LDHA后能抑制癌细胞的侵袭。

讨 论

正常增殖细胞通过线粒体中的氧化磷酸化产生ATP。相比之下，癌细胞依赖于有氧糖酵解，其中细胞摄取和代谢葡萄糖比正常组织更多，但使用较少葡萄糖进行氧化磷酸化，即使在氧气存在下也有利于糖酵解。然而，癌细胞中这种代谢转换的分子机制及其如何促进肿瘤生长和转移仍然未知。LDHA 是一种催化丙酮酸和NADH 转化为乳酸和NAD+的酶，在调节糖酵解中具有关键作用。癌细胞通常具有上调的LDHA，其促进代谢转换为有氧糖酵解并产生乳酸。一些研究表明LDHA 在肿瘤进展中的作用。有研究报道指出，LDHA 的酪氨酸磷酸化通过调节白血病细胞和含有失调的成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)的肺癌细胞中的NADH/NAD+氧化还原稳态来促进癌细胞代谢并增强肿瘤生长。LDHA 敲低减弱糖酵解并影响线粒体生理学功能，导致乳腺癌模型中肿瘤生长严重下降[3]。LDHA 的下调还抑制肝细胞癌细胞和鼠4T1 乳腺肿瘤细胞的肿瘤生长和转移[4]。已知靶向LDHA 的下调可诱导活性氧(ROS)产生并抑制肿瘤进展，并且这些可被抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸部分逆转[5]。这些发现提供LDHA 在人类癌症中发挥关键作用的证据，因此可能是治疗癌症希望的靶标。

LDHA 是丙酮酸转化为乳酸的必需物质，它优先在癌细胞中表达，并与较低存活率相关。研究证明LDHA 对于癌症起始细胞的存活和增殖至关重要。抑制LDHA对癌细胞(如乳腺癌和肝癌细胞)具有抗增殖作用[6]。LDHA 的表达减少能降低ATP 水平，并在淋巴瘤和胰腺癌细胞中诱导氧化应激和细胞凋亡。研究表明LDHA 是一种在多种肿瘤细胞代谢中起关键作用的酶。据报道，LDHA 与胃癌、肾细胞癌等癌症的临床病理特征和生存结果相关[7]。

为评估LDHA 在乳腺癌中表达与生物学功能，我们首先通过qRT-PCR 检测发现LDHA 在人乳腺癌细胞中高表达，然后通过转染si-LDHA 干扰人乳腺癌MDA-MB-231 细胞中LDHA 的表达。通过MTT 实验发现在人乳腺癌MDA-MB-231 细胞中干扰LDHA 后，细胞增殖能力明显减弱。Transwell 实验结果显示在人乳腺癌MDA-MB-231 细胞中干扰LDHA 后，细胞的侵袭能力亦明显被抑制。目前，LDHA 在乳腺癌中的分子调控机制研究还处于起始阶段，继续深入LDHA 在乳腺癌中的研究，将为乳腺癌潜在治疗靶点的挖掘提供新的思路。