包装纸中异噻唑啉酮的检测技术研究

朱翔 汪宣 王蕾 徐文君 项佳凝 徐莹 陈丽娜

摘要：建立了一種超高效液相色谱法测定（UHPLC）包装纸原纸和包装纸中2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮（MI）、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮（CMI）和1，2-苯并异噻啉-3-酮（BIT）含量的快速分析方法。样品经水溶液超声提取、离心、有机滤膜过滤后，进行液相分析，EclipsePlus C18 RRHD色谱柱分离，流动相选择甲酸水-甲醇溶液，采用梯度洗脱方式。此外，还对提取溶剂、提取时间、紫外检测波长进行了研究。在最优检测条件下，三种异噻唑啉酮在0.02～5.0 mg L-1范围内均呈良好的线性关系（R2均大于0.999），包装纸原纸中，低、中、高浓度加标回收率在80.7～99.4%之间，相对标准偏差不高于3%，MI、CMI、BIT的检出限分别为0.0204、0.0310、0.0397 mg kg-1，定量限分别为0.0680、0.103、0.132 mg kg-1。包装纸中，低、中、高浓度加标回收率在80.9～112.4%之间，相对标准偏差不高于6%，MI、CMI、BIT的检出限分别为0.0286、0.0189、0.0264 mg kg-1，定量限分别为0.0954、0.0631、0.0880 mg kg-1。该方法已应用于实际样品的检测，有望为包装纸的绿色、安全印刷提供保障。

关键词：异噻唑啉酮；检测技术；超高效液相色谱法；包装纸；绿色印刷

中图分类号：TB484 文献标识码：A 文章编号：1400 （2020） 06-0059-05

A Rapid Determination of Isothiazolinone In Packaging Paper

ZHU Xiang， WANG Xuan， WANG Lei， XU Wen-jun， XIANG Jia-ning， XU Ying， CHEN Li-na（Shanghai Tobacco Packaging And Printing Co.， LTD.， Shanghai 200137， China）

Abstract： A rapid ultra-high performance liquid chromatography （UHPLC） method was developed for the quantitative anaylsis of three isothiazolinone biocides （2-methyl-4-isothiazolin-3-one （MI）， 5-chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one （CMI） and 1，2-benzylisothiazolin-3-one （BIT） in original paper samples and packaging paper. Before UHPLC analysis， the sample was extracted with water， and purified by ultrasonic extraction， centrifugation， and filtration. The sample was separated using a EclipsePlus C18 RRHD column. The mobile phases was formic acid water-methanol under gradient elution. Besides， factors such as extraction solvents， extraction time， and UV detection wavelength were also studied. Under the optimized condition， the method exhibited a linear relationship in the concentration range of 0.02～5.0 mg L-1 （R2>0.999）. In original paper samples， the spike recovery for low， medium and high concentration was in the range of 80.7～99.4% with the relative standard deviations less than 3%. The limits of detection （LOD） were 0.0204、0.0310、0.0397 mg kg-1 and limits of quantification （LOQ） were 0.0680、0.103、0.132 mg kg-1. In packaging samples， the spike recovery was in the range of 80.9～112.4% with the relative standard deviations less than 6%. The limits of detection （LOD） were 0.0286、0.0189、0.0264 mg kg-1 and limits of quantification （LOQ） were 0.0954、0.0631、0.0880 mg kg-1. The method with high accuracy has also been applied to the determination of isothiazolones in real samples. It is a potential technical for green and safe printing of packaging paper.

Keywords： isothiazolones， rapid determination， ultra-high performance liquid chromatography method， packaging paper， green and safe printing

引言

异噻唑啉酮类物质由于抗菌能力強、应用剂量小、溶解性好、低毒性、低残留、易降解等优点，已被广泛用于水处理、钢铁冶炼、油田注水、炼油厂、火力发电厂、大型化肥厂、造纸厂、轻纺、水涂涂料、工业清洗等领域[1]。其中，制浆造纸工业中为防止纸张生产过程中浆料腐败、变质，常使用2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮（MIT）、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮（CMI）和1，2-苯并异噻唑啉-3-酮（BIT）作为防腐剂。尽管异噻唑啉酮类物质毒性较低，但它与皮肤接触可能引起过敏或皮炎等反应，过量接触还可导致皮肤灼伤[2]。国内外对食品接触材料、玩具、化妆品等日用品中相关异噻唑啉酮类杀菌剂的使用均有严格的限制，我国食品容器和包装材料标准对MIT、CMI和BIT的限量要求分别为0.5 mg/kg、不能检出（N.D.=0.01 mg/kg）和1.2 mg/kg [3]，烟草行业也将三类有机杀菌剂列为关注物质，对其有明确的最大使用量要求。[4]

目前，异噻唑啉酮类杀菌剂的检测方法主要包括分光光度法[5]、液相色谱-紫外法（HPLC-UV）[6]、液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）[7]和气相色谱质谱法（GC-MS）[8]。分光光度法中涉及到使用还原剂、显色剂，步骤较繁琐、容易引入二次污染；异噻唑啉酮类物质极性较大、沸点较高，需衍生化后才能进行GC/MS分析，衍生化过程耗时长且需进一步净化，增加了检验时间，而且会导致回收率降低；LC-MS/ MS方法虽然有较好的回收率、较低的检出限、较高的灵敏度，但是三重四极杆液质联用仪仪器昂贵、参数设置较为复杂，对检测者的实验能力提出很高的要求，因此检测成本较高；同时，碰撞电压以及离子源等的优化需要较长的时间，造成检测的时间偏长。相比较而言，HPLC-UV方法仪器较为简单、操作较为便捷，进行简单的前处理后即可上样分析。然而，高效液相色谱法的局限性也很明显，烟用纸张种类较多，其生产和印刷工艺较复杂，且异噻唑啉酮类杀菌剂含量较低，它带来的问题是在检测较低浓度样品时可能出现假阴性的现象或者受到样品中其他物质的干扰。如何提高检测灵敏度是有机杀菌剂检测中的关键所在。超高效液相色谱的出现可以解决目前的问题。超高效液相色谱法的原理与高效液相色谱法基本相同，但有更多的优点：（1）UHPLC能够使用更小颗粒的高性能微粒固定相。固定相的颗粒越小、微孔孔径越大、传质阻力就越小，传质速率就越高，这样的孔径更加利于物质分离。（2）超高压输液泵的使用可以充分发挥色谱柱的作用，快速分离样品。（3）UHPLC采用高速采样、灵敏度更高的检测器，提高分析物质的能力。（4）UHPLC进样系统使用低扩散、低交叉污染自动进样器。配备了针内进样探头和压力辅助进样技术，使进样更为精确、降低污染的可能性。总之，与传统的HPLC法相比，UHPLC的分析速度、灵敏度及分离度分别是HPLC的9倍、3倍及1.7倍，仅缩短了分析时间，同时减少了溶剂用量降低了分析成本。[9]

目前国内虽然有烟用水基胶中异噻唑啉酮类杀菌剂部分研究报道[10-11]，但卷烟包装纸中有机杀菌剂的研究以及相关标准较少，为此，开发高灵敏、高效的有机杀菌剂检测技术具有较为实际的意义。

1 实验部分

1.1仪器与试剂

仪器：Agilent 1290 Infinity II超高效液相色谱仪（美国Agilent公司，配有二极管阵列检测器）；电子天平（感量：0.1 mg，瑞士Mettler Toledo公司）；移液器（德国brand公司）；5804R高速离心机（德国eppendorf公司）；Milli-Q超纯水仪（美国Millipore公司）；2700TH超声波清洗器（上海安普实验科技股份有限公司）；cary 100紫外光谱仪（美国Agilent公司）。

试剂：MI、CMI和BIT（纯度≥98%，德国Dr公司）；色谱纯乙腈、甲醇、甲酸、0.22 μm有机相滤膜、一次性注射器（上海安普实验科技股份有限公司）；各种规格、容量瓶和具塞锥形瓶（德国witeg公司）：符合GB/T6682规定的一级水。

1.2色谱条件

分析柱：EclipsePlus C18 RRHD（50×3.0 mm，1.8μm）；柱温：30℃；进样量：10 μL；流速0.5 mL/min；DAD检测波长：0～2.5 min：275 nm，2.5～7.0 min：318 nm；流动相A为0.1%甲酸-水，B为甲醇；梯度洗脱条件：0～2.5 min，A相为75%，B相为25%；2.5～5.0 min，A相为75%，B相为25%；5.0～7.0 min，A相为75%，B相为25%。由保留时间定性，外标法定量。

1.3标准溶液的配制

分别准确称取5 mg MI、CMI和BIT于50 mL容量瓶，用水定容配制成浓度为100 mg L-1的标准储备溶液；分别取20、50、100、200、1000、3000、5000 μL的混合标准溶液，用水溶液定容至100 mL容量瓶中，得到0.02、0.05、0.1、0.2、1.0、3.0、5.0 mg L-1系列标准溶液。

1.4样品前处理

称取2.0 g试样，精确至0.1 mg，置于50 mL具塞三角瓶中，准确加入20 mL水，盖紧瓶塞，在超声仪上以100 W功率超声30 min，取上层清液过0.22μm有机相滤膜，滤液置于进样瓶中待液相色谱分析。

2 结果与讨论

2.1色谱条件选择

2.1.1检测波长的确定

分别取三种标准溶液与比色皿中，在230～500 nm范围进行紫外光谱扫描，如图1所示，结果表明MI、CMI和BIT的最大吸收波长分别为275 nm、275 nm和318 nm，因此选择275 nm和318 nm作为检测波长。

2.1.2流动相的选择

实验考查了甲酸水溶液-乙腈、甲酸水溶液-甲醇為流动相的两个体系对分离分析的影响。甲酸水溶液-乙腈体系虽然分析时间更短，但考虑实际样品检测时基质对测试会有一定影响，三个紧挨着的峰可能会被基质干扰，因此采用甲酸-水溶液进行洗脱。

2.1.3流动相比例的优化

考察了三个梯度洗脱条件对色谱峰分离的影响。当采取梯度洗脱1条件进行实验时，三个色谱峰得到有效分离，并且峰形较尖，然而峰与峰之间时间间隔较长，有进一步优化的空间。因此采用2中条件进行实验，其保留时间均缩短，然而第三个色谱峰的峰形欠佳。针对第三个峰的分离采用条件3进行优化，当甲酸水-甲醇的体积比为75：25时，BIT和MI两种异噻唑啉酮的分析时间较短、峰形较好，保留时间分别为0.64和1.59 min。当甲酸水-甲醇的体积比为50：50时，CMI分分离情况较好，保留时间为2.59 min。考虑到实际样品检测时，基质会引入较多的杂峰，易产生干扰，三种物质的保留时间不宜过近，才有利于利用外标法进行分析。因此，最终确定的流动相比例为条件3，标样及样品的色谱图如图2所示。

2.2 样品前处理方法优化

2.2.1提取溶剂的选择

文献报道了三种异噻唑啉酮易溶于甲醇、丙酮、乙腈和乙酸乙酯等有机溶剂，也易溶于水。实验针对不同极性的提取剂进行考察。结果发现，乙腈提取效果差；甲醇对BIT这种物质的回收率较差，仅为50%左右，而水作为提取剂的回收率均在80%以上，因此本研究最终选用了水作提取剂。一方面可以降低使用有机溶剂，实验过程较为绿色环保；另一方面可以避免甲醇溶剂效应的影响，文献报道纯甲醇提取液直接进样时，MI有明显的溶剂效应，因此，上机前采用超纯水稀释来降低溶剂效应，但这会导致实验步骤繁琐、灵敏度降低。[12]

2.2.2 提取时间的选择

比较了超声提取时间为20，30，40，50 min时样品中三种目标物的峰面积情况，实验结果见表2，可见超声提取时间对目标物含量测定的影响不明显，但考虑到实际样品中目标物提取的充分性，因此选择振荡时间为30 min。

2.2.3 工作曲线、检出限和定量限

在最优条件下，对浓度为0.02～5.0 mg L-1的标准工作溶液进行测定，以目标物峰强度（Y）对标准工作溶液的浓度（X）进行标准曲线绘制，MI、CMI和BIT在0.25～5.0 mg L-1范围内呈良好的线性关系，相关系数都为R2=0.9999。将最低浓度的标准溶液平行测定6次，所得测定结果标准偏差的3倍为方法检出限（LOD），10倍为方法定量限（LOQ），包装纸原纸中 MI、CMI、BIT的检出限分别为0.0204、0.0310、0.0397 mg kg-1，定量限分别为0.0680、0.103、0.132 mg kg-1；包装纸样品中，MI、CMI、BIT的检出限分别为0.0286、0.0189、0.0264 mg kg-1，定量限分别为0.0954、0.0631、0.0880 mg kg-1。

2.2.4 精密度和准确度

精密度是以相对标准偏差的形式表示。平行试验的精密度可用以验证方法的重复性。选取三个加标浓度分别进行6次平行实验，所得结果见表3、表4，在三个加标水平上，结果的相对标准偏差均小于5%，结果表明方法的精密度良好。

准确度一般通过回收率的结果体现，实验测试了三个加标水平上的6个平行实验的加标回收率的平均值，所得结果见表3、表4。包装纸原纸中，低、中、高浓度加标回收率在80.7～99.4%之间，相对标准偏差不高于3%。包装纸样品中，低、中、高浓度加标回收率在80.9～112.4%之间，相对标准偏差不高于6%。结果表明，该分析方法对异噻唑啉酮的测定结果具有准确性。

2.2.5 实际样品的分析

应用所建立的方法测定包装纸、包装纸原纸中异噻唑啉酮的残留量，结果如表所示，表明包装纸中异噻唑啉酮的使用量差异显著，对其使用量进行标准化管理具有很强实际意义。

3 结论

本工作利用超高效液相色谱法建立了一种包装纸和包装纸原纸中甲基异噻唑啉酮的快速、高效的检测方法。该方法前处理条件绿色环保，避免使用大量的有机溶剂；检测时间较短，是一种快速的定性定量方法；线性范围较宽，不仅满足低浓度样品检测，也可以可靠测量高浓度样品。不足之处在于液相方法靠保留时间定性，容易受到基质干扰，因此，进一步工作将聚焦前处理方法的优化，以减少基质效应带来的问题。

参考文献：

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[2] 王磊，武绍峰，顾学斌.异噻唑啉酮类杀菌剂的应用研究.工业微生物，2015（5）：60-64.

[3] GB 9685-2016，食品安全国家标准 食品接触材料及制品用添加剂使用标准.

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[5] Willingham G L，Derbyshire R L. Use of hydrazide stabilizers for 3-isothiazolones： US，5118699.[P]. 1992-06-02.

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[9] 申海鹏.全新一代UHPLC系统，重新界定超高效液相色谱.食品安全导刊，2015（10）：28-29.

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[11] 周晓，叶长文，李小兰，范忠，陈志燕，李栋，周芸，王维刚.液相色谱-串联质谱法测定烟用纸张中3种异噻唑啉酮类杀菌剂.烟草科技，2016（8）：57-63.

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