微孔多糖止血微球的止血作用及体内降解试验研究

黄艳妮，何小华，刘 纯，赵 丹，程艳玲

（山东省药学科学院新药评价中心，济南 250101）

0 引言

外科手术、战争和日常生活中因失血过多造成的死亡事件屡见不鲜，快速有效的止血可以减少出血量及患者痛苦，降低死亡率，因此研发快速止血且可吸收的止血材料是科研工作者努力的方向[1-2]。常用的可吸收止血材料包括纤维蛋白胶、凝血酶抑制剂、聚乙二醇聚合物、壳聚糖和微孔多糖止血微球等，其中微孔多糖止血微球因具有快速的止血效果和良好的生物兼容性，受到越来越多研究者的关注[3]。国内使用的微孔多糖止血微球大多从美国进口，用于创伤止血时可快速形成凝胶混合物，达到即刻止血的效果，但该产品价格昂贵，临床应用受到了一定的限制[4]。目前，国内很多科研院所都在研究具有自主知识产权的新型微孔多糖止血微球[5-6]。本文通过创建新西兰兔腹壁、小鼠股动脉和股静脉混合部位及大鼠肝脏部位的活跃出血创面，评价我院研制的新型微孔多糖止血微球对不同创面的止血效果，并通过肝脏创面考察微孔多糖止血微球的降解情况，为微孔多糖止血微球的临床应用提供更多试验动物数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

AristaTM止血微球，即市售对照品（美国Medafor-Inc生产，批号：M28851）；微孔多糖止血微球，即供试品（山东省药学科学院提供，批号：20180726）；戊巴比妥钠（德国默克公司生产，批号：170108）。

1.2 实验动物

新西兰兔18只，体质量2.2～2.7 kg，雌雄各半，济南西岭角养殖繁育中心提供，生产许可证号：SCXK（鲁）20150001。新西兰兔饲养于本中心二楼普通级饲养间，室温：16～26℃，日温差：≤4℃，相对湿度：40%～70%；换气次数：≥8次/h；昼夜明暗交替时间：12 h/12 h。动物使用许可证号：SCXK（鲁）20140008。

健康KM小鼠30只，体质量25～29 g，雌雄各半；SD大鼠90只，体质量230～300 g，雌雄各半。均由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，生产许可证号：SCXK（鲁）20150001。大鼠、小鼠饲养于万级屏障系统，室温：20～25℃，日温差：≤3℃，相对湿度：40%～70%，换气次数：10～20 次/h；压强梯度：20～50 Pa；昼夜明暗交替时间：12 h/12 h。动物使用许可证号：SCXK（鲁）20140008。

本试验经过本中心伦理委员会批准。

1.3 主要仪器

ACS-JJ-Tiger型电子计价秤，梅特勒-托利多（常州）测量技术有限公司生产；Tissue-Tek VIP6全封闭组织脱水机，日本樱花公司生产；NP-B型生物组织包埋机，湖北诺普医疗器械有限公司生产；RM2235型切片机，德国Leica公司生产；TK-218型摊烤片机，湖北泰维医疗器械有限公司生产；Ni-u荧光显微镜，日本Nikon公司生产。

1.4 实验方法

1.4.1 新西兰兔腹壁创面止血试验

将18只健康新西兰兔按性别、体质量随机分为模型组、供试品组和市售对照品组3组，每组6只。新西兰兔经戊巴比妥钠（3%，约30 mg/kg）麻醉后，仰卧固定于手术台上，常规脱毛、消毒、开腹，用手术刀片横向划破新西兰兔腹壁内侧造成出血创面，创面大小一致（长5 mm、深3 mm），用无菌纱布擦拭创面后，供试品组和市售对照品组分别将供试品和对照品（约0.3 g）喷洒至创面止血，同时开始计时。模型组擦拭创面后，不做任何处理。每隔30 s用滤纸条轻轻蘸吸创面，直至滤纸条上不再沾有血液为止，记录所需时间即为有效止血时间。

1.4.2 小鼠股动脉和股静脉混合创面止血试验

将30只健康KM小鼠按性别、体质量随机分为模型组、供试品组和市售对照品组3组，每组10只。小鼠经腹腔注射戊巴比妥钠（1%，约50 mg/kg）麻醉后，常规脱毛、消毒，在小鼠右后肢的皮肤暴露股动脉和股静脉，用灭菌的手术刀切断股动脉和股静脉，用无菌纱布擦拭创面后，供试品组和市售对照品组分别将供试品和对照品（约0.1 g）喷洒至创面止血，并开始计时。模型组擦拭创面后，不做任何处理。每隔30 s用滤纸条轻轻蘸吸创面，直至滤纸条上不再沾有血液为止，记录所需时间即为有效止血时间。用分析天平精确称量止血前后滤纸条的质量，计算每只小鼠的出血量：出血量（ml）=（止血后滤纸片质量-止血前滤纸片质量）/血液质量浓度（1.050 g/ml）。

1.4.3 大鼠肝脏创面止血试验及降解情况观察

将90只健康SD大鼠按性别、体质量随机分为模型组、供试品组和市售对照品组，每组30只。大鼠腹腔注射戊巴比妥钠（1%，约40 mg/kg）麻醉，仰卧固定于手术台上，逐层开腹，游离并暴露肝脏左叶，用组织剪在肝脏左叶中间位置剪下大小一致的一块肝组织，造成敞开型伤口（4 mm×4 mm），自由出血5 s后，擦去喷出的血液，供试品组和市售对照品组分别将供试品和对照品（约0.1 g）喷洒至创面，模型组的创面擦去血液后，将纱布覆盖在创面处止血。然后用10 g砝码压20 s，取下观察30 s。如果创面仍在出血再按上述步骤操作，如此循环直到止血为止。记录每只大鼠的止血时间。

术后1、14、28 d分别从上述3组中，随机取10只大鼠进行解剖，肉眼观察供试品组和市售对照品组肝脏创面处止血微球的降解情况；取肝脏创面处组织进行组织病理学检查，在光学显微镜下观察供试品的降解情况，评估止血微球的安全性。止血微球安全性考察依据GB/T 16886.6—1977《医疗器械生物学评价 第6部分：植入后局部反应试验》。

1.5 数据统计

实验数据采用±s表示，使用SPSS 18.0软件进行统计分析。止血时间和出血量采用单因素方差比较分析后进行最小显著性差异法（least significant difference，LSD）或 Tamhane’s T2 两两分析，P＜0.05表示有统计学差异。

2 结果

2.1 新西兰兔腹壁止血试验

在新西兰兔腹壁止血试验中，模型组、供试品组和市售对照组的止血时间分别为（300±28）、（196±54）和（175±46）s。与模型组相比，供试品组和市售对照品组均能明显缩短腹壁创面的止血时间（P＜0.05），但供试品组与市售对照品组之间无统计学差异（P＞0.05），止血效果相当。

2.2 小鼠股动脉和股静脉止血试验

小鼠股动脉和股静脉止血试验结果见表1。由表1可以看出，与模型组相比，供试品组和市售对照品组均能够明显缩短止血时间、减少出血量（P＜0.05），但供试品组与对照品组之间无统计学差异（P＞0.05），止血效果相当。

表1 小鼠股动脉和股静脉创面止血效果（±s，n=10）

表1 小鼠股动脉和股静脉创面止血效果（±s，n=10）

注：*表示与模型组比较，P＜0.05

组别 止血时间/s 出血量/ml模型组 180±31 0.61±0.17供试品组 85±27* 0.31±0.15*市售对照品组 84±22* 0.33±0.11*

2.3 大鼠肝脏止血试验

大鼠肝脏创面止血试验结果见表2。由表2可以看出，与模型组相比，供试品组和对照品组均能够明显缩短止血时间、减少出血量（P＜0.05），但供试品组与对照品组之间无统计学差异（P＞0.05），止血效果相当。

表2 大鼠肝脏创面止血效果（±s，n=30）

表2 大鼠肝脏创面止血效果（±s，n=30）

注：*表示与模型组比较，P＜0.05

组别 止血时间/s 出血量/ml模型组 360±48 1.68±1.04供试品组 220±76* 1.30±0.80*市售对照品组 231±58* 1.29±0.78*

2.4 大鼠肝脏降解试验

2.4.1 大体观察

术后1 d，3组大鼠肝脏左叶创面轮廓清晰，供试品组和市售对照品组大鼠创面处肉眼观察无止血微球；术后14 d，3组大鼠肝脏左叶创面基本愈合，供试品组和市售对照品组创面处肉眼观察无止血微球；术后28 d，3组大鼠肝脏左叶创面全部愈合，未见异常。不同时间点的大鼠肝脏外观如图1所示。

图1 不同时间点的大鼠肝脏外观

2.4.2 HE切片观察

术后1 d，镜下观察供试品组和市售对照品组肝脏局部被膜可见少量、弱嗜酸性、球样、大小不均的物质，周围可见炎性细胞，可见少量未降解的止血微球；术后14 d，供试品组和市售对照品组有50%创面局部存在未降解的止血微球；术后28 d，供试品组和市售对照品组创面均无未降解的止血微球。不同时间点的大鼠肝脏病理切片如图2所示。

图2 不同时间点的大鼠肝脏病理切片（HE染色，10×）

3 讨论

市面上止血材料种类繁多，按来源分为生物制品类、硅铝酸盐类及多聚糖类。大多数生物制品来源于动物，止血过程需凝血因子或者血小板的参与，止血时间相对较长，且生物制品来源于动物，具有免疫原性和感染的风险。硅铝酸盐类是一种特殊结构的矿物质，具有排列整齐、大小规则且与外界相同的通道，可选择性吸收血液中的水分，使血液中的血小板和凝血因子快速浓缩，多用于战争中大面积的创伤止血。多聚糖类包括壳聚糖和微孔多糖止血微球。壳聚糖是一种来源于海洋的高分子化合物，存在一定的致敏性，同时在广泛止血方面具有一定的局限性。微孔多糖止血微球是一种新型的植物淀粉多糖止血材料，用于渗血创面时，分子内部的孔隙发挥强大的吸水能力，瞬间吸收血液中的水分形成微球凝胶，同时血液中孔径大物质如红细胞、纤维蛋白、血小板等聚集在微球表面，形成血球凝胶，启动内源性凝血机制。这2种凝胶混合物同时封堵出血点，在数分钟内发挥止血作用。该止血剂不含有活性的生物成分，止血迅速、使用方便、毒副作用小，是近年来发展最快的一种可降解材料[7]。目前，临床上使用的微孔多糖止血微球多为进口产品，如AristaTM和PerClotTM，这类产品可用于心胸外科、神经外科、骨外科、耳鼻喉科等多种外科手术的止血。此外这类产品还具有防止肠粘连的作用，但因价格昂贵，限制了其临床应用[8-9]。

本文考察了微孔多糖止血微球对新西兰兔腹壁创面、小鼠股动脉和股静脉创面、大鼠肝脏创面的止血效果，并考察了止血微球在大鼠体内的降解情况。结果显示，微孔多糖止血微球可以显著减少止血时间和出血量，止血效果与市售对照品相当；在降解试验中，微孔多糖止血微球在28 d完全降解，肉眼及显微镜下观察均无样品残留，安全性较高，与市售对照品相当。综上，微孔多糖止血微球是一种止血效果好、安全性高的止血材料，值得进一步开发研究。

但本文仅进行了体表创伤、小血管创伤及肝脏等一般外科手术创伤的研究，没有进行胸外、骨外、妇科手术创伤的研究。此外，在考察产品的安全性方面，没有观察供试品对主要脏器（如心、肝、脾、肺等）的影响。今后要根据实际需要，扬长避短，选择合适的动物模型，全面评估微孔多糖止血微球的止血效果及安全性。