超量共表达NSAKT1和ATDWF4烟草抗渗透胁迫能力研究

韦春 秦利军

摘要：为了解钾和油菜素内酯（BRs）在调控植物抗逆境胁迫中的作用，以超量表达K吸收基因NSAKT及BRs合成基因AIDF4的转基因烟草为材料，分析PEG渗透胁迫对其形态及抗性指标等的影响。结果表明，PEG胁迫3d时，转基因烟草SOD活性即达到极值且显著高于非转基因烟草（Wt），其中以共转AKTI/DWE4植株中SOD活性最高;而PG胁迫1d时，3种转基因植株的POD活性均显著（《005）高于Wt植株，且共转AKTIDWF4植株中POD活性分别是单转AKT植株的1.28倍、单转DF4植株的1.40倍和W植株的1.90倍PEG胁迫第3天时，共转AKTDF4植株中CAT活性增幅最大，达59.18%，显著高于其他2种转基因烟草。同时，H2O2和MDA含量定表明，PEG处理后Wt中MDA和HO2含量均在第5天时达极值，分别为58.52nong和38.21gg，均显著高于转基因烟草。另外，特征基因表达分析表明，NsAK和ATDWFE4可能协同调控共转1KTI/DWF4烟株对PEG渗透胁迫的抗性。本研究为进一步揭示K和BRs协同介导的烟草抗逆境胁迫应答机制以及创制优良的烟草新种质奠定理论依据。

关键词：烟草;AKT：DF4;抗旱性

钾不仅能维持植物细胞内稳态平衡和控制气孔开闭，还能改善烟草制品的安全性。环境中K主要是通过质膜上的K通道（potassium channel，PC）进入植物体内4。PC根据结构和功能不同，又可分为Shaker家族通道、KCO家族通道和其他通道。钾转运蛋白1（Arabidopsis-ike e potassium transporter，AKT）是Shaker家族中的K钾离子通道，能在低K环境（10 umol/L）中促进植物吸收K79。在水稻（Oryza sativa）中，OSAKTI既能调节水稻在盐胁迫下对K的吸收，又能提高水稻对干旱胁迫的抗性。

近年来，植物激素（plant hormones）介导的非生物胁迫抗性也被广泛报道。其中，油菜素内酯（brassinosteroids，BRs）作为一种重要的甾醇类激素，参与了细胞分化、维管束发育及植物抗逆等过程1。芸苔素内酯（brassinolide，BL）作为BRs的活性形式，其生物合成已被证明至少需要经由3条途径，而DF4是催化这3条途径的关键限速酶718。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，该酶与拟南芥类固醇羟化酶（Constitutive photomorphogenesis and dwarfism，CPD）具有43%的同源性。研究发现，超量表达DIF4不仅能增加油菜（Brassica napus）种子产量和对小球腔菌（Leptosphaeria maculans）和菌核病（Sclerotinia sclerotiorum）的抗性，还能有效改善拟南芥和番茄（Solanum lycopersicum）的营养生理状态尽管OSAKT1和DF4两者单独调控植物发育及抗性较多，但鲜有对两者协同介导的非生物胁迫应答进行报道，本试验立足于提高烟叶中钾素含量和改善烟叶品质，研究两者间协同促进转基因植株对渗透胁迫的抗性，以期为培育钾含量高、抗旱能力强的烟草新种质提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

普通烟草（Nicotiana tabacum）品种K326，植物表达载体pRI201-35SAKTI、pRI201-rdDw4和pRI201-35SAKTI/rddwfa4均由贵州大学农业生物工程研究院保存、构建并提供。植物激素及抗生素购于Sigma-Aldrich公司;植物表达载体pRI201-AN购于Takara公司;普通质粒小提试剂盒及新型植物DNA提取试剂盒均购于TIANGEN BIOTECH公司;Multiscribe M Reverse Transcriptase Kit n POWERSYBRGreen PCR Master MixKit均购自Applied Biosystems公司物对F-35Sakt/R-Akthsp和F-IddwfR-Dwfhsp及Real-timePCR分析相关引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2方法

1.2.1载体构建以购自Takara公司的植物表达载体pRI201-AN（Code No.3264）为起始载体，利用Ne和SalI对其进行双酶切，同时以这2个酶双酶切人工合成的、两端含有NeI和SalI酶切位点的NSAKTI基因序列。分别胶回收上述两种酶切产物，酶切产物依次经T4DNA连接酶连接和酶切验证后，构建植物表达载体pRI201-35 Saktl（图1A）。利用KpI和Nor对植物表达载体pRI201-35Aktl进行双酶切：利用KpI和NorI对植物表达载体pRI20-AN（Code No.3264）进行双酶切，同时以这2个酶双酶切人工合成的、两端含有KpnI和NorI酶切位点的ATDWF4基因表达元件。ADF4基因表达元件由A.thaliana rd29A基因启动子、A.thaliana DWF4基因及A.Thaliana HSP基因终止序列3部分组成。分别胶回收上述两种酶切产物，酶切产物依次经T4DNA连接酶连接和酶切验证后，构建植物表达体pRI201-rddwf（图1B）。以构建的pRI201-35 SAKTI为中间载体，利用KmI和NoI将ADWF4基因表达元件从植物表达载体pRI201-rdDw4切下并连接入pRI201-35Aktl中并最终构建构建植物表达载体pRI201-35 SAKTI/rddw4（图1C）。

1.2.2煙草转化及转基因植株鉴定参照农杄菌转化法2，以含3个质粒的工程农杄菌分别对栽培烟草K326进行遗传转化，按照谭颖等2的方法对侵染的叶块进行后续培养。提取抗性烟株总基因组并以其为模板，用特异性引物F-201（-GACGGCCAGTGCCAAGCTTG-3）/R-AKT（5'-CCACACATAGAAACTCCTAAAACTCC-3）FAF-rd（5_GGGCCAATAGACATGGACCGACTAC-3R-DWF（5-CCGAGTGTTGTGGCGGTGTAC-3）对抗性植株进行PCR鉴定。F-201R-Akt引物扩条件为4℃2min：94C，30s，58C，40s，72C，1min，30个循环：72℃，5min：4℃维持。F-Rd/R-Dwf引物扩增条件为：94℃，2min94℃，20s，60℃0s，72℃，1min，28个循环：72℃，5min：4℃维持。

1.2.3转基因烟草PEG渗透胁迫处理以稳定遗传的T1代转基因烟草和同批繁殖的非转基因烟草（K326）为材料，在16h光照/28℃，8h黑暗/23℃条件下萌发生长，待烟苗长至6～8叶期时，移栽至花盆（盆高18cm，直径15cm，每盆裝培养基质5kg），置于温度为（252）℃，湿度70%，光照为1800x，光周期为16h光照/8h黑暗的人工培养箱中恢复培养5d。参照张祎等2的方法以20%PEG-6000溶液处理K326及转基因烟苗，分别取PEG-6000处理前（0d）及处理1、3和5d的相同部位（自下向上第4叶）烟叶1g，液氮速冻后置于-80℃冰箱保存，用于测定烟叶中的抗氧化酶antioxidant enzymes，AOEs）活性;同时取PEG-6000胁迫处理前（0d）及处理6、12和24h的相同部位（自下向上第5叶）叶片1g，液氮速冻后置于-80℃冰箱保存，用于烟叶中K吸收及BRs合成相关基因表达分析。设3个生物学重复。

1.2.4MDA及H2O2含量测定以PEG-6000处理前（0d）及处理1、3和5d的叶片为材料，参照南京建成生物工程研究所丙二醛（MDA）测定试剂盒（TBA法，A003-1-2）及H2O2测定试剂盒（比色法，A064-1-1）方法制备待测样，分别于532和405mm波长下测定吸光值，计算MDA和H2O2含量。每组设3個生物学重复。

1.2.5AOEs活性测定参照南京建成生物工程研究所POD（比色法，A084-3-1）、SOD（WST-1法，A001-3-2）和CAT（可见光法，A007-1-1）酶活力测定试剂盒说明书操作制备待测样，待测样分别在420、550和405m波长下吸光值，计算POD、SOD和CAT酶活力。每组设3个生物学重复。

1.2.6K吸收及BR合成相关基因表达分析分别取PEG胁迫处理前（0h）和胁迫6、12和24h的转基因与非转基因烟草相同部位叶片组织0.1g，按照OMEGA Plant RNA Kit试剂盒说明提取总RNA，并按Applied Biosystems，反转录操作将RNA反转录为cDNA。使用美国ABI7500实时荧光定量PCR仪检测转基因烟株叶片中K吸收相关基因，如HAK1、AKT1、NP1和TORKI以及BRs合成相关基因（DF4、DET2、CPD和RO73）的相对表达量，以烟草B-Acin作为内参基因（表1），每个样品设3个重复。

1.2.7数据处理采用SPSS18.0软件进行数据处理，Duncan法分析其差异显著性。

2结果

2.1植物表达载体的构建及酶切验证

构建了以CaMV35S启动子驱动N.sylvestrisAKT表达（CaM35：NSAKT）的植物表达载体pRI201-35 SAKTI，以A.haliana rd294基因启动子启动A.thaliana DWF4基因（ATDWF4）表达（r29A：AIDF4）的植物表达载体pRI201-rddwfe4和同时含有上述两个表达元件（CaM/：NSAKT1和r29A：ATDWF4）的植物表达载体pRI201-35SAKTI/Rddwft4。pR201-35SAkt1经NleI/SaI双酶切可产生2682bp和10432bp两条带（图2A）;pRI201-rdidwf4经Kpn I/NotI双酶切可产生2552bp和10432bp两条带（图2B）pRI201-35SAkt-rddwf4经NdeNotI双酶切后可产生5484bp和10182bp两条带（图2C）。说明目标片段已经整合到质粒载体中。

2.2转基因烟株获得及PCR鉴定

分别以含有pRI201-35SAkl、pRI201-rddwf4以及pRI201-35SAKTI-rddwfe4质粒的工程农杆菌对K326叶片进行遗传转化，经一系列培养后获得抗性植株（图3A）。剪取抗性烟株叶片0.1g提取总DNA，以特异性引物F-201R-Akt对转pRI201-35SAk载体的烟株进行鉴定，可扩增产生993bp大小的特异性条带（图3B）：以引物F-RdR-Dwf对转pRI201-rddwf载体的烟株进行鉴定，可扩增产生554bp大小的特异性条带（图3C）而共转植株可同时扩增到993bp和54bp两条特异带（图3D）。最终，鉴定到单转NSAKT植株56株，单转ADF4植株42株，共转NSAKTIATDWF4植株38株。

2.3PEG胁迫对转基因烟草生长的影响

PEG胁迫试验表明，3～5叶期转基因和非转基因（W）植株经PG胁迫3d后，单转ATDWF4植株（Dw）和单转NSAKT7植株（Ak）均出现了不同程度的萎蔫，而共转NSAKTILATDWF4的烟株（AkDw）仅少数叶片出现萎蔫，Wt叶片完全萎蔫、变黄（图4A）：68叶期的转基因烟苗对PG胁迫均表现出一定的抗性，但在胁迫处理10d时，单转植株（Ak和Dw）的萎蔫程度显著高于AkDw植株，而W植株在处理10d时叶片（完展叶和心叶）完全萎蔫，且下部叶片为焦枯色（图4B），说明无论是3～5叶期的小烟苗，还是68叶期的大烟苗，AkDw植株都表现出较强的耐旱性。可见共转NSAKTIATDWF4植株耐旱性高于单转AIDF4植株，高于单转NSAKT植株。

2.4PEG胁迫对不同烟株理化指标的影响

2.4.1PEG胁迫对MDA及H2O2含量的影响由图5可以看出，PEG胁迫处理前，转基因和非转基因烟株MDA含量差异不显著。在胁迫1～5d时，非转基因烟草MDA含量始终显著高于转基因烟草说明PEG胁迫可引起非转基因烟株MDA的显著积累。在PEG处理第5天时，AkDw植株MDA含量显著低于Ak植株、Dw植株和W植株，表明其在应答PEG渗透胁迫时，AkDw植株能更有效地降低脂膜氧化产物MDA的积累，进而保护植物细胞。在PEG胁迫处理前，Dw植株H2O2含量显著低于其他3种植株，但PEG渗透胁迫1d时，Dw烟草中的H2O2迅速积累且幅仅次于Ak/D植株。在PEG渗透胁迫1d时，转基因植株中H2O2含量增幅均显著高于非转基因植株。胁迫处理3d和5d，非转基因烟草中H2O2含量始终显著（《005）高于转基因植株。在PEG渗透胁迫5d时，除Ak/Dw植株H2O2含量降低外，Ak和W植株H2O2含量增幅均高于D植株。这一现象说明，不同转基因植株应答PEG渗透胁迫时引起植物体积累H2O2的能力不同，进而反映出植株所受H2O2氧化程度也各异。

2.4.2PEG胁迫对AOEs活性的影响胁迫处理前，转基因与非转基因植株AOEs活性无显著差异（图6）。在胁迫3d时，转基因烟草的SOD活性均显著高于非转基因烟草，其中以共转AKT/DF4烟株的最高，达44.28U，其次是单转DWF4植株，为40.45U。同时，在PEG处理第3天时，单转DWF4和共转AKTI/DF4烟株的POD活性达到极值，分别为338.16和384.37U。4种烟草株系CAT活性总体上表现为持续加的变化趋势，但幅有一定差异。在PEG胁迫处理第3天时，共转AKTIDWF4植株CAT活性増幅最大，较胁迫处理1d时增加59.18%，其余2种转基因植株CAT活性增幅也较非转基因植株显著。以上结果表明，转基因植株能有效并迅速地提高AOEs的活性来消除由于PEG渗透胁迫引起的H2O2、O2·等超氧化物的积累，且不同转基因植株表现出调动AOEs活性存在一定差异。

2.5PEG胁迫烟草植株K吸收及BR合成基因表的影响

2.5.1K吸收相关基因表达由图7可见，在PEG渗透胁迫24h内，Ak、Dw和AkDw植株HAK基因表达量不断增加，但以Dw植株增幅最为显著。AKT基因在Ak和AkDw植株也呈逐步上升趋势，且ー直显著高于Dw和Wt植株，这可能与AKT在Ak和AkDw植株中的超量表达有关。在PEG渗透胁迫6h时，转基因烟株中P表達量显著高于W植株，随着胁迫时间的增加，仅AkDw植株中的NPl表达量始终显著高于W植株。TROKI在转基因植株中表达変化与HAK基本相似，但表达量增幅有一定差异，以Ak植株最高，Ak/Dw其次，Dw植株最低。进一步分析发现，PEG渗透胁迫不仅诱导Dw植株AK基因的表达上调，同时也引起Ak和Ak/Dw植株中AKT的表达量加而AK和AKT在调控植物应答低钾等非生物胁迫抗性中具重要作用;另外，PEG渗透胁迫还使Ak和AkDw植株中TROK基因显著上调表达推测转基因植株在应答PEG介导的渗透胁迫时，一方面通过调节K富集相关基因的表达实现对K的吸收以提高K介导的抗旱应答胁迫能力;另一方面为了维持植物内K含量稳定，K外排通道随即启动以平衡机体内的钾含量。

2.5.2BRs合成相关基因表达由图8可以看出，PEG渗透胁迫24h内，DWF4基因在Dw和AkDw植株中的表达量始终显著高于Ak和W植株，且在胁迫12h时Dw植株中DF4基因的表达量最高显著高于其他烟草植株。在PEG胁迫6～12h内，Dw和AkDw植株中的DET2基因表达量均显著高于Ak和Wt植株，且二者间也存在显著差异，而在PEG胁迫24h时DE72在AkDw和Dw植株中的表达差异不显著。渗透胁迫后，CPD在转基因烟草中表达趋势一致，即随着胁迫时间增加，CPD表达量逐强増，但不同转基因植株中的增幅有一定差异，始终以在AkDw植株中的表达量最高。除Dw植株外，在PEG胁迫6～12h内，RO73在Ak、Ak/Dw和W植株中的表达量无显著差异，但在胁迫处理24h时，AkDw中ROT3表达量迅速上调，显著高于Dw、Ak和Wt植株。DWF4作为BRs生物合成中的关键限速基因，其表达量的高低直接影向下游基因的表达。本研究中PEG渗透胁迫引起了Dw和AkDw植株中DF4在6h时即出现显著表达，暗示这两类转基因植株可通过迅速调控BRs的合成以启动BRs介导的抗性信号通路的表达。同时，在胁迫处理后期（24h）AkDw植株中BRs合成中下游基因DET2、CPD和RO73的高表达也表明，在应答PEG渗透胁迫时AkDw植株内积累更多的BRS。

3讨论

在植物中，K作为重要的渗调物质和电荷载体不仅参与了细胞生长、气孔开闭以及内稳态平衡等多种生命活动，而且在多种生物胁迫（biotic stress与非生物胁迫（abiotic stress）抗性中具有十分重要的作用。植物从外界吸收K主要依赖于K通道蛋白和K转运体两类系统3，AKT1是从Ahaliana突变体中鉴定到的一种耐低钾（10 umol/L）及非生物胁迫的重要K通道蛋白。此外，BRs是从油菜（Bra.ssica napus）花粉中分离的一种植物类固醇激素（steroid he ormone）3，在调节植物生长发育和逆境胁迫中也具有重要作用143。DF4可编码A.thaliana细胞色素P450（cytochrome P450），该蛋白是BRs生物合成中的关键限速酶，介导BRs生物合成过程中的多个22-羟基化（22 alpha-hydroxylation）步骤339。本文结果表明，无论是3～5叶期的共转NSAKT和AIDF4的小烟苗，还是68叶期的大烟苗都表现出对PG渗透胁迫一定的抗性，说明NSAKT1和Atw4的共同导入能明显增强转基因烟草的耐旱能力。产生这一现象原因可能包括2个方面，其一是NSAKT的超量表达引起了K含量的迅速积累，同时激活了由K介导的抗非生物胁迫应答;其二是ADHF4的过表达也可能引起了转基因烟草中BRs含量增加，故转基因植株在应答渗透胁迫时能迅速调动BRs介导的抗逆境通路基因的表达来提高作物的耐旱能力。

PEG渗透胁迫引起了各烟草植株中H2O2不同程度的积累，但在胁迫处理3d和5d时，非转基因烟草中H1O2含量始终显著（p《0.05）高于转基因植株，且在胁迫处理第5天时H2O2含量比共转NSAKT1和ATDWF4植株高37.4%;另外，H2O2的逐渐积累引起了植株细胞脂膜不断氧化产生MDA，但非转基因植株中MDA的积累量却显著（p《0.05高于转基因植株。说明转基因植株能有效降低PEG渗透胁迫所引起的过氧化物（H2O2）及其氧化产物（MDA）的积累，从而減少植物细胞损害。YU等报道了转细菌冷休克蛋白（bacterial cold shock protein）基因Secspa的小麦可通过降低MDA含量、失水率等指标提高抗旱能力;张袆等2研究超量表达NTHAKI烟草时也发现其应答干旱胁迫时MDA含量显著低于非转基因植株。AOES活性测定结果表明，在PEG胁迫前3d，转基因烟草的SOD、POD和CAT活性始终高于非转基因植株，但不同烟草株系抗氧化酶活性有一定差异。在PEG胁迫第5天时，除SOD外，转基因植株中其余两种酶活性仍显著（p《0.05）高于非转基因植株，这与GAO等的研究结果一致。说明转基因植株应答PEG渗透胁迫时，能够迅速调动机体的抗氧化酶系统（antioxidase system）对过量积累的O2、H2O2等进行有效的清除。同时，在转基因植株中较低的H2O2含量证明高AOEs活性实现了H2O2的还原，从而起到保护植物的作用。

在PEG脅迫的单转NSAKT1和共转NSAKTIATDWF4植株中同时检测到了较高的AKT1和TORK1表达，推测AKT基因的高表达可能会引起植物中K的大量积累，植物体通过调节TORK的表达增强过剩K的外排，以稳定细胞内正常的钾素平衡，这一结果与谭颖等研究MHAK超量表达引起TORK基因上调的结果类似。同时，PGE渗胁迫还引起了BRs合成相关基因DWF4、DET2、CPD和ROT3的差异表达。这些基因在单转ADWF4烟草和共转NSAKTI和ATDWE4烟草中的高表达引起了BRs的迅速积累，从而提高植物的抗旱性。这是由于BRs一方面可通过促进可溶性蛋白和渗透调剂物的积累及水分和气体交换提高作物对干的耐受性454，另方面可以通过与其他植物激素（如ABA和ET）或信号通路（如SApathway）互作来影响植物的抗旱性。与单转NSAKT1和ATDWE4烟草相比，PEG渗透胁迫引起了共转NSAKT1和ATDWF4烟草中4个BRs合成关键基因DWF4、DE72、ROT3和CPD显著上调，表明共转烟株应答渗透胁迫时引起了BRs积累。

4结论

超量共表达N.sylvestris AKT1和A.thalianeDWF4能显著增强转基因植株对PEG渗透胁迫的抗性，共转NSAKTATDWF4烟株比单转NsAK、单转ADF4以及非转基因植株（W）表现出高AOEs（SOD、POD和CAT）酶活性以及MDA和H2O2含量的降低，且可通过协同调控K吸收及BRs合成相关基因的表达实现转基因植株对渗透胁迫的应答。本研究可为培育富钾、耐旱烟草新种质提供理想的亲本材料。

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