铅（Pb2+）和镉（Cd2+）对火炬树种子萌发及幼苗生长的影响

曲同宝，杨塍希，马文育，王 影

（吉林农业大学 园艺学院，吉林 长春 130118）

土壤重金属污染不仅影响到土壤生态功能，也威胁到人类健康与社会发展，因此一直受到人们广泛关注[1]。引起土壤环境污染的常见重金属有汞（Hg）、铅（Pb）、镉（Cd）、砷（As）、银（Ag）等具有生物毒性元素，以及过量则具有毒性的锌（Zn）、铜（Cu)、镍（Ni）、铬（Cr）等微量元素[2]，其中铅、镉已成为我国城市地表土壤中含量超标最多的重金属，且富集情况严重[3-4]。近年来，大量电子垃圾混入生活垃圾后被堆埋至城郊、乡镇等简易垃圾场，致使垃圾场及其周围土壤环境铅、镉大量积累，加剧了城市土壤重金属污染问题[5]。以往铅、镉对植物的毒害作用和植物对这两种重金属的解毒机理的研究，多集中在生物量小且生长缓慢的草本超富集植物方面[6-8]，找寻生物量大、生长速度快的木本耐重金属污染植物显得尤为重要。植物种子萌发时期对外界环境极为敏感，通过研究重金属胁迫条件下种子萌发能力与幼苗生长特性，可一定程度反映植物对重金属的耐受性[9]。研究发现，随着重金属铅和镉浓度的增加，许多林木种子的发芽率呈现出先升高后降低的趋势，但是不同的植物表现不同[10]。

火炬树Rhus typhina是漆树科Anacardiaceae盐肤木属Rhus落叶灌木或亚乔木，有一定入侵性，但因其具有繁殖速度快、生态位广阔、抗旱保水、耐盐碱、适应性极强等特点，现被广泛应用于荒山造林与城市园林建设[11-12]。Bache 等[13]研究发现，火炬树叶片中存在镉的积累；陈颖等[14-15]研究表明火炬树根孽苗也可用于尾矿地水土的保持，这表明火炬树对铅、镉2 种重金属表现出一定的抗性与富集能力，具备作为植物修复的前提条件，但目前火炬树对重金属铅、镉胁迫的耐受程度及抗性机理仍不清楚。本研究以火炬树种子为试验材料，测定不同程度重金属铅、镉胁迫对火炬树种子的发芽率、发芽指数、幼苗生长形态指标的影响，探讨其耐重金属铅和镉的相关机理，以期为工矿业废弃地、垃圾填埋场等重金属污染严重土壤选用植物修复材料提供理论和实践依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

火炬树种子采自吉林农业大学校园内，千粒重为10.46 g（采用砂纸处理去除红色绒毛状蜡质外种皮）。

1.2 种子处理与萌发

首先用90 ℃开水进行浸种，待开水自然冷却后浸泡24 h，再用蒸馏水浸泡2 h，无菌滤纸吸干待用[16]。根据城市垃圾填埋场重金属污染程度设定Pb2+、Cd2+浓度[17]。Pb(NO3)2和CdCl2作为供源，均为分析纯试剂。Pb2+溶液浓度设定为0（以去离子水为对照）、300、600、900、1 200、1 500 mmol/L；Cd2+溶液浓度设定为0（以去离子水为对照）、140、280、420、560、700 mmol/L。

将两张滤纸平铺于直径9 cm 玻璃培养皿中，进行高温灭菌处理。灭菌后分别加入以上处理液 3 mL，并保证滤纸充分浸湿且无气泡。每个培养皿中放入经催芽后大小均一、籽粒饱满、结构完整的火炬树种子30 粒，每个处理重复3 次。最后将培养皿置于人工气候培养箱中进行培养，相对湿度为60%。光照培养条件：温度25±1℃，光强3 500 lx，时间14 h。黑暗培养条件：温度20±1℃，时间10 h。依据滤纸湿度情况，1～2 d补充相应浓度的处理液1 mL，每24 h 观察并记录种子萌发情况。

1.3 发芽指标与形态学指标的测定

以胚根突破种皮2 mm 为种子萌发标志，待发芽末期连续2 d 无萌发时视为发芽结束，共计7 d。统计植物发芽数，计算发芽率、发芽指数；测量不同处理下幼苗的胚根长和茎长，计算根伸长抑制率、芽伸长抑制率。

（1）式中：GR为发芽率；A为发芽种子数；B为供试种子数。

式中：GI为发芽指数；Gt为种子在第t日的发芽数；Dt为相应的发芽天数。

式中：Ir为根伸长抑制率；Cr为对照组根长；Tr为处理组根长。

式中：Is为芽伸长抑制率；Cs为对照组芽长；Ts为处理组芽长。

1.4 生理指标的测定

火炬树出苗10 d 后测定相关生理指标。硫代巴比妥酸（TBARS）含量的测定采用比色法[18]；可溶性蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝G-250 染色法；超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定采用氮蓝四唑光还原法；过氧化物酶（POD）活性的测定采用愈创木酚显色法[19]。

1.5 数据处理

用Excel 2016 进行数据统计，用Sigmaplot 14.0 作图。用SPSS17.0 进行单因素方差分析和差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 Pb2+、Cd2+胁迫对火炬树种子萌发的影响

研究结果显示，不同浓度的Pb2+、Cd2+溶液均可对火炬树种子的发芽率、发芽指数产生显著影响（P＜0.05）。随着2 种重金属浓度的升高，发芽率均显著降低。当Pb2+浓度为1 500 mmol/L和Cd2+浓度为700 mmol/L 时，抑制作用最强，发芽率分别为72.22%和64.45%，比对照降低了21.05%、29.55%；发芽指数分别为5.55 和4.17，比对照降低了22.49%、41.76%（表1）。

表1 重金属对火炬树种子萌发的影响†Table 1 Effects of heavy metal on seed germination of R. typhina

2.2 Pb2+、Cd2+ 胁迫对火炬树幼苗根及芽伸长的抑制效果

火炬树幼苗生长对重金属Pb2+、Cd2+胁迫表现出不同的响应（P＜0.05）（图1）。Pb2+处理对火炬树幼苗根伸长、芽伸长产生低浓度促进而高浓度抑制的效应：当Pb2+浓度为300 mmol/L 时，与对照相比，根长和芽长伸长得到促进；当Pb2+浓度为1 500 mmol/L 时，抑制作用显著，根伸长抑制率为65.68%，芽抑制率为25.74%。Cd2+胁迫下，随着浓度的增加抑制作用更加明显，根长、芽长均显著低于对照组，Cd2+浓度与抑制率呈正相关。重金属对火炬树幼苗根的伸长抑制效果均大于对芽的抑制效果（表2）。

2.3 Pb2+、Cd2+胁迫对火炬树幼苗生理活性的影响

2.3.1 对TBARS 含量的影响

随着溶液浓度的增加，TBARS 含量先减少后增加。当重金属Pb2+浓度小于600 mmol/L、Cd2+浓度小于140 mmol/L 时，火炬树幼苗体内TBARS 含量呈降低趋势，但是当Pb2+浓度为 300 mmol/L 时，TBARS 含量与对照相比差异不显著。当Pb2+浓度为1 500 mmol/L 和Cd2+浓度为700 mmol/L 时，TBARS 含量分别较对照增加了77.96%和107.45%，与对照呈显著差异（P＜0.05）（表3）。TBARS 含量不断积累，表明植物叶片细胞膜损伤程度逐渐增强。

2.3.2 对可溶性蛋白含量的影响

随着2 种重金属浓度的增加，可溶性蛋白含量均呈先升高后降低的趋势，各处理组均高于对照组，且差异显著（P＜0.05）（表3）。当Pb2+浓度为600 mmol/L、Cd2+浓度为280 mmol/L 时，对可溶性蛋白含量的促进效果最强，分别比对照高了347.67%和152.71%（P＜0.05），可通过火炬树幼苗体内可溶性蛋白含量的高低变化间接表明其总代谢能力的强弱。

图1 重金属Pb2+、Cd2+对火炬树幼苗形态特征的影响Fig.1 Seedling morphology characteristics of R.typhina under Pb2+ and Cd2+ stress

表2 根长与芽长抑制率的回归方程†Table 2 The inhibition regression equation of root and shoot

2.3.3 对SOD 酶活性的影响

2 种重金属对火炬树幼苗叶片SOD 活性均表现出低浓度促进而高浓度抑制的作用（P＜0.05）（表3）。当Pb2+浓度为900 mmol/L 时，火炬树幼苗SOD 活性的产生能力最强，比对照提高了60.98%，与对照呈显著差异（P＜0.05）。当Pb2+浓度为900 mmol/L、Cd2+浓度为280 mmol/L 时，SOD 酶活性开始降低；在Pb2+浓度为 1 500 mmol/L 与Cd2+浓度为700 mmol/L 下，酶活性水平显著降低并达到最小值，分别比对照降低了34.53%、56.54%，与对照呈显著差异（P＜0.05）。

2.3.4 对POD 活性的影响

火炬树幼苗体内POD 活性随着2 种重金属溶液浓度梯度的升高大致呈递增趋势（表3）。随着Pb2+浓度的升高，POD 活性迅速提高，当浓度为1 500 mmol/L 时，POD 活性达到最大值，比对照提高了149.44%，表现出强烈的促进作用。在Cd2+处理下，酶活性仅在浓度为420 mmol/L 时较对照降低了1.68%，而后随处理浓度增大呈急剧增大的趋势，并均显著高于对照，在浓度为700 mmol/L时，比对照增加了107.87%（P＜0.05）。

表3 重金属对火炬树生理指标的影响†Table 3 Effects of heavy metal on physiological indexes of R.typhina

3 结论与讨论

1）Pb2+、Cd2+作为植物非必需元素，对植物的毒害深远，从植物种子萌发、幼苗生长和成熟植株开花结实等都会有很强的毒害作用，可抑制植物呼吸作用、固氮作用和光合作用等代谢活动，使植物的生长发育受到影响[20-22]。本研究发现，不同浓度重金属Pb2+、Cd2+胁迫均抑制火炬树种子萌发，这与2 种重金属对毛竹Phyllostachys pubescens[10]和黑麦草Lolium perenne[20]种子胁迫的研究结果一致。火炬树幼苗期根和芽伸长抑制率随Cd2+浓度增加而增大，但Pb2+胁迫时则表现出低浓度促进而高浓度抑制的效果。低浓度Pb2+可能诱导产生了少量活性氧（ROS），如羟基自由基（-OH），能促使植物根细胞壁变疏松，从而促进根伸长生长；随着处理浓度的增大或时间的增加，ROS 过度积累，导致植物细胞质膜中不饱和脂肪酸氧化，膜结构受损而功能失调，进而影响植物生长[23]。本研究中，2 种重金属对幼苗根系产生的毒害作用比对芽更为显著，这与毛竹[10]、枫香Liquidambar formosana[24]的结果一致，可能是因为根部细胞壁大量固定的Pb2+会影响Ca2+跨膜运输，使Ca-ATP 酶与钙调素CAM 无法激活，影响根尖细胞的有丝分裂，减少植物根系对其他营养成分的吸收，最终抑制植株地上部分的生长[25]。

2）TBARS 表示植物质膜过氧化水平及细胞膜受伤害程度，TBARS 含量越高，膜质过氧化水平越高，过量的TBARS 能够降低和改变质膜的流动性和结构稳定性，最终破坏质膜的完整性[26]。本试验中，随着重金属浓度的增加，火炬树幼苗叶片中TBARS 含量呈逐渐上升趋势，这与水稻Oryza sativa[27]和小麦Typha angustifolia[28]在重金属胁迫下研究结果一致。研究表明，TBARS 的增长在一定程度上反映了植物体内氧自由基的数量与状态，重金属胁迫下TBARS 含量越高，羟基自由基（-OH）、超氧自由基（-O2-）等自由基积累量越高。氧自由基在强氧化剂过氧化氢（H2O2）作用下，通过Habe-weiss 反应可产生攻击力更强的-OH，启动膜脂过氧化，进一步导致TBARS 的增加并对植物产生伤害[29]。

3）可溶性蛋白作为植物体内重要的渗透调节物质，其含量的高低可间接代表植物体总代谢能力的强弱，也是体现植物应对重金属胁迫能力强弱的一个关键生理参数[30]。火炬树幼苗体内可溶性蛋白随着重金属浓度的增加呈先增加后降低的趋势，这与尚宏芹等[9]用Cd2+处理桔梗Platycodon grandiflorus种子的结果相似。在低浓度下，重金属Pb2+与金属硫蛋白（MT）络合成金属硫蛋白复合物（Pb-MT），Cd2+诱导植物合成螯合素（PC），再形成重金属螯合肽（Cd-PC），以减少细胞的毒害，Pb-MT和Cd-PC均可通过可溶性蛋白来反映[31-32]。当重金属浓度进一步加大时，Pb-MT 和Cd-PC 表达受到抑制，不能结合更多的Pb2+、Cd2+，可溶性蛋白含量降低，细胞受到伤害，进而植物生长被抑制。

4）植物维持体内活性氧动态平衡的能力也是评价其抗重金属污染能力的重要指标[33]。正常情况下，植物体内SOD 能将-O2-歧化为H2O2和-OH，POD 将H2O2分解成H2O，而在重金属胁迫下，会诱导-O2-、H2O2过量积累，打破植物体内活性氧动态平衡[34]。本试验研究表明，低浓度条件 （Pb2+＜300 mmol/L、Cd2+＜140 mmol/L）下，SOD 和POD 活性随Pb2+、Cd2+浓度的升高而增加，这可能是因为低浓度时，产生的低浓度活性氧可作为细胞中信号转导分子，诱导启动植物抗逆性基因的表达，植物抗氧化系统被激活，表现为SOD、POD 含量的增加[35]。当Pb2+浓度为1 500 mmol/L、Cd2+浓度为700 mmol/L 时，与对照相比 SOD 的活性分别降低了34.50%、56.54%，而POD 活性提高了149.44%、107.43%，这可能是随着ROS过度积累，植物体内ROS 动态平衡被打破，酶系统被破坏[36]，且由于植物种类的不同，植物抗氧化酶对Pb2+、Cd2+胁迫的敏感性不同，使得体内抗氧化酶响应变化能力也不同[7-8,37-40]。在Cd2+浓度为420 mmol/L时，POD 较对照降低了1.68%，这可能是一定阈值内Cd2+胁迫对火炬树幼苗酶活性有刺激作用，植物能通过运用自身酶促机制清除过氧伤害，表现出对Cd2+一定抗性。

5）Pb2+、Cd2+胁迫均抑制了火炬树种子萌发，除了Pb2+浓度为300 mmol/L 时促进其幼苗生长外，其它Pb2+、Cd2+胁迫均抑制了幼苗生长，但均未出现无根苗现象，并通过抗氧化酶系统等生理响应表现出多种积极的适应性特征，以缓解其毒害作用，这说明火炬树能够适应一定浓度的Pb2+、Cd2+环境，较其他木本植物种子对这2 种重金属表现出更强的耐性。因此火炬树可作为具有观赏价值和修复铅（Pb2+）、镉（Cd2+）污染土壤为一体的植物材料。

本研究仅完成了Pb2+、Cd2+单独胁迫下火炬树种子萌发、幼苗生长与生理指标的测定，室内研究也未能完全贴合自然条件，日后可通过盆栽试验模拟探索自然界中火炬树种子在重金属环境里的成长规律、存活状况、光合生理等。从幼苗长至成株后的抗逆解毒机理、富集规律、细胞结构与分子水平上的影响，有待日后进一步分析和探讨。