虾青素对创伤性颅脑损伤保护作用的研究进展

陈昊阳 王翀

创伤性颅脑损伤（traumatic brain injury，TBI）是指由于颅脑受到外部暴力时导致大脑病理生理学的改变，进而引起大脑功能受损。TBI 的病理生理机制复杂，涉及细胞和分子水平的各种变化，是原发性损伤和继发性损伤两个阶段的级联反应。TBI 的原发性损伤主要发生在撞击的瞬间，外部的冲击会导致细胞完整性的破坏，轴突应力剪切损伤，组织变形、挫伤，血脑屏障破坏等物理性损伤。而受损神经元释放的谷氨酸会导致继发性损伤级联反应，使细胞内线粒体功能障碍，氧化应激反应失衡，促炎因子增加，最终导致神经元和胶质细胞功能障碍、细胞凋亡、血脑屏障通透性改变、脑水肿、脑灌注减少等一系列继发性损伤，患者往往预后不良[1-3]。TBI 患者即使痊愈后也有可能出现认知和感觉运动障碍，如记忆减退、精细运动协调困难等，因此TBI 又被称为“沉默的流行病”[4-5]。在全球范围内，每年有超过1000 万人因TBI 住院治疗，世界卫生组织（World Health Organization，WHO）预测，到2020 年，TBI 将成为导致死亡和残疾的主要原因之一[6]。TBI 的损伤涉及多种病理生理机制共同参与，但这也为积极干预TBI 继发性损伤、进一步改善患者预后提供了可能。若能早期对TBI 患者采取有效的治疗，将更大程度地改善其预后及生活质量。虾青素（astaxanthin，ATX）是一种天然的叶黄素类胡萝卜素，其抗氧化活性是β-胡萝卜素的10 倍，是维生素E 的100 倍，被称为“超级抗氧化剂”[7]。许多研究显示ATX 具有对抗中枢神经系统急慢性损伤、保护神经、抗凋亡、改善灌注等多种生物学活性[8-10]。本文就ATX 的生物特性及其近年来在TBI 的保护作用机制等研究现状及进展综述如下。

一、虾青素的概述

（一）虾青素的来源

ATX 是一种与叶黄素、β-胡萝卜素同种的类胡萝卜素，动物不能主动合成ATX，只能通过食物摄取。某些酵母菌、细菌（金农杆菌）及植物可以从头合成ATX，并通过食物链的传递作用富集于甲壳纲目类动物（磷虾、龙虾、蟹类及贝类），鲑鱼目（如虹鳟鱼、鲑鱼）及鸟类羽毛中。雨生红球藻在高盐、高温或辐射环境下可合成大量ATX，是天然ATX 的最佳来源之一[11]。

（二）虾青素的化学特性

ATX的化学式为3,3'-二 羟 基-4,4'-二酮-β,β'-胡萝卜素，分子式为C40H52O4，相对摩尔质量为596.84 g/mol，属于不饱和萜烯类化合物[11]。ATX 包含两个由共轭双键连接的含氧β-紫罗兰酮环，使得ATX 可以通过提供电子与自由基反应，终止自由基在细胞内发生的连锁反应，从而产生抗氧化作用[12]。紫罗兰酮环末端的羟基和酮基是其拥有较高的抗氧化活性的原因。ATX 具有两个手性中心，分子末端的羟基使其能够酯化脂肪酸形成单酯或双酯。天然ATX 主要以酯化形式存在，而化学合成的ATX 主要为游离形式，ATX 有（3S-3'S）、（3R-3'S）、（3R-3'R）3 种立体异构体（图1）[13]。酵母菌或化工合成的ATX 为3 种异构体的混合物，比例约为1∶2∶1。雨生红球藻则主要合成3S-3'S 异构体，具有最强的生物活性，是目前研究的主要方向[14-15]。

（三）虾青素的生物利用度及安全性

ATX 见光易分解，且水溶性较差，直接口服的生物利用度较低。ATX 的亲脂性使得其在油性溶剂如食用油、丙酮、玉米油中有较好的利用度，并可通过血脑屏障[16]。食用油中的脂肪酸、胆固醇可以与ATX 结合形成酯化物，有利于其吸收利用。ATX 可与胆汁酸或脂肪酶结合，通过跨细胞膜扩散作用转移到小肠上皮细胞，由脂肪分子直接运输到相应的器官或组织发挥作用。未酯化的ATX 被结合到乳糜微粒中，并通过淋巴系统转运到肝脏后与低密度脂蛋白、高密度脂蛋白结合，再转运到相应的靶器官中发挥生物活性[17-18]。多项研究证明ATX 无急慢性毒副作用[19-20]。Kidd[21]研究证实ATX 在致畸性、胚胎毒性、生殖毒性等方面的安全性。1999 年，美国食品药品监督管理局将天然的ATX 批准作为膳食补充剂，推荐剂量为2～12 mg/d，建议连续应用不超过30 d。

图1 虾青素的立体异构体

二、虾青素在颅脑损伤中的保护作用

（一）虾青素的抗氧化损伤作用

TBI 可导致线粒体通透性转换孔开放，使1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP）生成1-甲基-4-苯基吡啶离子（1-methyl-4-phenylpyridiniumion，MPP+），抑制线粒体复合酶，破坏线粒体膜电位。而ROS、超氧阴离子自由基（O2-）和过氧化氢（H2O2）过度产生并与Fe2+反应生成羟基自由基（OH-）导致氧化应激反应激活，扰乱细胞功能并导致细胞凋亡[22]。

ATX 可以通过多种机制起到防御氧化损伤的作用，包括淬灭单线态氧、清除自由基、抑制脂质过氧化以及调节氧化应激相关基因的表达等[22-23]。ATX 在体内体外研究中均可对抗MPTP/MPP+诱导的线粒体功能障碍[24]。Augusti 等[25]在家兔食粮中添加ATX 后，测定血清抗氧化酶活性，结果显示ATX可以维持家兔体内的超氧化物歧化酶、硫氧还蛋白还原酶和对氧磷酶的活性，改善氧化应激损伤。Saw 等[26]报道ATX 可以清除HepG2-C8-ARE-荧光素酶细胞中的氧自由基，且比多不饱和脂肪酸、二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸抗氧化作用更加有效且安全，ATX 可提高细胞内谷胱甘肽的水平，增加抗氧化活性，还能上调核因子E2 相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）和受Nrf2 调控的NAD（P）H醌氧化还原酶1 [NAD（P）H:quinone oxidoreductase 1，NQO1]、血红素氧合酶-1（hemeoxygenase-1，HO-1）和谷胱甘肽硫转移酶2 的mRNA 转录表达，对抗ROS 引起的氧化损伤。也有学者认为ATX 通过激活酸肌醇-3 激酶和细胞外信号调节蛋白激酶，进而上调Nrf2 信号通路，促进Nrf2 从KEAP1 的解离，上调Nrf2 的核转位和DNA 结合活性，从而增强NQO1、HO-1和谷胱甘肽S-转移酶1 的活性对抗神经系统的氧化损伤[27]。该研究通过给予TBI 小鼠模型ATX 治疗，24 h 后相关数据显示实验组小鼠大脑的氧化应激损伤、脑水肿、血脑屏障破坏及细胞凋亡水平均较对照组有明显下降。

（二）虾青素的抗炎作用

炎症反应是机体受到损伤时产生的保护机制，可启动组织修复功能，清除损伤组织，但是过度的炎症反应会导致机体细胞和组织的损伤。ATX 可通过调节小鼠神经前体细胞p38 蛋白和MEK 信号通路，维持线粒体完整性，减少线粒体释放细胞色素C，抑制Caspase-3 蛋白活化和H2O2介导的炎症反应[28]。在Balietti 等[29]的研究中报道了ATX 可以通过下调小鼠脑组织及海马内白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-10 及肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α），发挥抗炎作用。在Zhang 等[30]的实验中，发现ATX 可以减少中性粒细胞浸润，并可通过mRNA 在转录及蛋白质合成中下调核因子-kappa B（nuclear factor kappa-B，NF-κB）通路的活性，减少髓过氧化物酶、炎性细胞因子IL-1β、TNF-α 和细胞间黏附分子-1 的持续表达显著减轻大脑炎症。Wen 等[31]研究发现ATX 可以通过低密度脂蛋白受体相关蛋白-1 下调JNK、NF-κB信号通路逆转脂多糖诱导的BV2 小胶质细胞极化，降低p-IKKα、p-IκBα 和p-p65 的水平。ATX 促进BV2 细胞M2 极化的同时抑制M1 活化，促使其从M1 表型向M2 表型分化，提高抗炎介质并下调炎症介质的表达发挥抗炎作用。

上述研究表明ATX 无论在体内还是体外模型中均可在蛋白质及mRNA 水平持续抑制炎症介质的产生，减少炎性细胞的浸润，表现出良好的抗炎作用。

（三）虾青素减轻脑水肿及抗凋亡作用

Na+-K+-2Cl-共转运蛋白1（Na+-K+-2Cl--cotransporter 1，NKCC1）与水通道蛋白4（aquaporin 4，AQP4）是室管膜细胞和星形胶质细胞表达的主要亚型，与TBI 诱导的脑水肿有关[32-33]。一项研究发现ATX 可以抑制NKCC1 mRNA 的转录，通过抑制NKCC1 的活化，下调AQP4 表达水平来减轻TBI 后细胞毒性水肿和血管源性水肿，改善TBI 后脑水肿的程度[34]。进一步研究发现ATX 还可诱导细胞内NF-κB 通路的表达，上调Bcl-2 基因表达，降低促凋亡因子Bax 基因表达，抑制内质网中Ca2+的异常释放，减少Ca2+的消耗[35]。Bcl-2 和Bax 的平衡对于细胞内环境平衡起重要作用，ATX 通过上述机制进而抑制NKCC1 的表达，减轻星形胶质细胞、室管膜细胞的凋亡。ATX 可通过MEK 信号通路提高P-Akt、P-MEK 的活化水平并抑制P-GSK3b 等促凋亡蛋白表达，减少乳酸脱氢酶的释放以及Caspase-3 的活性来恢复线粒体的膜电位，抑制H2O2介导的细胞凋亡[28]。Ji 等[10]通过口服途径给予TBI 小鼠模型ATX，发现ATX 可通过恢复大脑皮层中的脑源性神经营养因子、生长相关蛋白43、突触蛋白和突触素的表达水平，减少大脑皮层损伤面积及神经元损伤程度，提高神经元的存活率，促进小鼠认知功能的恢复；与对照组相比，治疗组小鼠的神经系统严重程度评分及感觉运动表现评分均有明显改善。

（四）神经保护作用

有研究报道TBI 患者在其晚年更容易患上阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病[36-38]。ATX 可降低红细胞中磷脂氢过 氧化物（phospholipid hydroperoxides，PLOOH）的异常累积，PLOOH 是磷脂的主要氧化物，在红细胞中过量累积会导致红细胞向大脑供氧减少。Nakagawa 等[39]研究发现ATX治疗后试验组人群红细胞中PLOOH 水平较对照组有明显下降，表明ATX 可以改善红细胞抗氧化状态，有助于预防痴呆。ATX 具有良好的血脑屏障通透性，对神经系统表现出潜在的保护性。认知功能受损是TBI 患者常见症状，近年来，许多体内外模型的研究显示ATX 可减轻认知障碍[9,40]。最近的一项研究表明，在大鼠饮食中添加ATX 后，可在海马和大脑皮层积聚，影响认知功能的维持和改善，ATX 通过降低细胞内ROS 水平，增加HO-1 的表达，从而降低MPP+以及PC12 细胞产生的细胞毒性[41]。ATX 可以抑制乳酸脱氢酶释放，增加Bcl-2 的表达、抑制Caspase-3/8/9 的活性并裂解PARP，抑制细胞内ROS 的积累。ATX 还可增加抗氧化反应元件（antioxidant-responsive element，ARE）的活性，启动Nrf2 转位，增加HO-1 表达，保护HT22 细胞，减少细胞毒性物质释放发挥神经保护作用[42-43]。

目前的研究结果表明，TBI 后应用ATX 能够减轻TBI 引起的感觉运动和认知功能缺陷。ATX 通过模拟神经营养因子和促进突触存活等机制减少大脑皮层损伤面积、神经元细胞凋亡与脑皮层神经变性，发挥神经保护作用。

三、展望

TBI 是一种常见的神经系统急症，具有较高的致残率、死亡率，TBI 后的脑水肿、炎症浸润、血脑屏障破坏、细胞凋亡等多种继发性损伤常常严重损害神经系统功能，是导致患者预后不佳的重要原因。近年来许多研究证明ATX 在中枢系统急慢性疾病均可通过发挥多种保护机制对抗神经系统损伤。ATX 具有良好的安全性，并且能够通过血脑屏障，而且具有强大的对抗氧化应激、抗炎、抗细胞凋亡、减轻脑水肿的作用，在治疗TBI 的原发性及继发性脑损伤方面有着良好的作用。多项体内外实验证明服用ATX 后，TBI 继发性脑损伤级联反应、神经元变性、血脑屏障破坏、脑水肿和神经功能障碍等方面均得到改善，并且可改善动物的认知、感觉及运动功能，提高神经系统敏感性（表1）。这为ATX 未来应用于TBI的临床试验提供了依据。但由于ATX 的水溶制剂生物利用度较低且易氧化的特点，将ATX 剂整合为其他形式制剂，克服ATX 的稳定性、溶解度等方面的缺陷，以提高ATX 的生物利用度将是继续研究的重点，并且需要进一步进行ATX 的最佳给药途径及其治疗时间窗、最佳治疗剂量等方面的相关研究。

表1 虾青素对创伤性颅脑损伤保护作用总结

综上所述，ATX 可通过多种机制对抗TBI 继发性损伤，有望成为治疗TBI 继发性损伤的理想药剂。目前ATX 仍有一些作用机制尚不完全清楚，需要进一步研究ATX 在中枢神经系统疾病中所涉及的精确的病理生理途径及作用机制是下一步的研究方向，也为将来ATX 在TBI 的临床应用提供更多的理论和实践依据。