MicroRNA-938 及其靶基因TGFBR1 单核苷酸多态性与出血性脑卒中的关联研究

宋波 程云 姜玉章 沈冲 薛永 李婴慧

出血性脑卒中（hemorrhagic stroke，HS）是脑血管疾病中的一组以脑部出血性损伤为主要临床表现的疾病，具有发病率、病死率、致残率及复发率高的特点，是威胁人类健康的主要疾病之一[1]。HS 也是脑卒中最严重的一种类型，其80%的患者6 个月后有不同程度的神经功能障碍，生活不能自理[2]。但目前HS 具体的发病机制尚不清楚。

转化生长因子-β1（transforming growth factorβ1，TGF-β1）是一种多功能的细胞因子，参与体内多种病理和生理过程，可能通过免疫-炎症调节、神经细胞保护作用、促血管生成作用、损伤修复作用及抗凋亡作用减轻脑卒中后脑损伤，在急性脑血管病中发挥脑保护作用。在心血管系统中，TGFβ1 参与血管平滑肌细胞增殖、细胞外基质的沉积和血管重塑导致血管弹性下降、血管硬化从而增加血管破裂风险。多项动物实验和流行病学研究表明人体TGF-β1 的水平与心血管疾病的发生密切相关[3-6]。TGF-β1 通过与转化生长因子β 受体1（transforming growth factor β receptor 1，TGFBR1）结合而发生生物学效应，当TGFBR1 异常增加或者构型改变时就会影响TGF-β1 的生物学效应，从而促进心血管疾病的发生发展[7]。TGFBR1 由TGFBR1基因转录表达并受到结合该基因3'非转录区的微小RNA-938（microRNA-938，miR-938）调控。前期研究发现携带TGFBR1 基因rs12346650 的A 等位基因个体的高血压患病风险显著增加[8]。最近，有研究发现，TGFBR1 基因变异在loeys-dietz 综合征患者发生脑血管事件的病理机制中发挥重要功能[9]。本研究同时纳入分析TGFBR1 基因rs12346650 位点和miR-938 基因（MIR938）少见等位基因型频率＞0.05 的位点rs2505901，分析其多态性与HS的关系。

资料与方法

一、调查对象与调查内容

本研究采用病例-对照研究设计，以淮安市第一人民医院和淮阴区医院自2008 年1 月至2013 年7月收治的239 例急性HS 患者为病例组，993 例无脑卒中史的社区人群为对照组，按照年龄匹配。对照组包括高血压人群（439 例）和血压正常人群（554 例）。高血压人群为同一医院确诊为高血压的患者，病例组入选标准为通过CT 或MRI 确诊为HS 的患者，排除因外伤或者其他原因引起的脑出血。HS 类型包括基底节区出血、脑叶出血、脑桥出血、小脑出血、脑室出血。本项研究通过了医院伦理委员会的批准，并取得研究对象的知情同意。

人群和临床资料收集包括年龄、性别、高血压史、Ⅱ型糖尿病史、心血管疾病和脑卒中史等并检测血压，同时采集空腹静脉血检测血糖（glucose，GLU）、甘油三酯（triglycerides，TG）、胆固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白（lowdensity lipoprotein cholesterol，LDL-C）。

二、基因分型方法

采用聚合酶链式反应-限制性内切酶片段长度多态性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）的方法进行基因分型。两个位点的引物、识别的限制性内切酶和酶切片段信息见表1。

PCR 扩增反应体系：模板DNA 10 ng，引物各1 pmol，1×PCR buffer，2.5 mmol/L MgCl，2 mmol/L dNTPs，0.5 U TaqDNA 聚合酶，总体积10 μL。酶切体系：5 μL PCR 产物，3.8 μL 水，2 U 限制性内切酶，1 μL 10×buffer，37℃水浴12～16 h。酶切产物经3%琼脂糖凝胶电泳进行分离。rs12346650 位点PCR扩增长度为110 bp，经限制性内切酶AvaII 识别酶切片段分别为GG（87 bp+23 bp）、GA（110 bp+87 bp+23 bp）和AA 基因型（110 bp）；rs2505901 位点PCR扩增长度为588 bp，经限制性内切酶BseLI 识别酶切片段分别为TT（322 bp+266 bp）、CT（588 bp+322 bp+266 bp）和CC 基因型（588 bp）。随机抽取5%对象进行重复基因分型，结果符合率达到99%以上。

表1 rs12346650 和rs2505901 位点PCR-RFLP 分析引物、限制性内切酶及酶切片段大小

三、统计学分析

数据采用Epidata3.1 双重录入电脑，经比对无误后进一步整理，用软件SPSS13.0 进行统计学分析。计量资料用均数±标准差（Mean±SD）表示，2 组均数比较用成组t 检验；计数资料采用Fisher 精确概率法或χ2检验。对rs12346650 和rs2505901 两个基因位点分别按相加模型[CC，CT，TT（0，1，2）；GG，GA，AA（0，1，2）]、显性模型[CC vs CT+TT（0，1）；GG vs GA+AA（0，1）]和隐性模型[CC+CT vs TT（0，1）；GG+GA vs AA（0，1）]进行遗传关联分析。应用Logistic 回归模型进行多因素分析，校正年龄、性别、糖尿病史、高血压病史、TC、TG、HDL-C 和LDL-C 因素，对性别进行分层分析。以双侧P＜0.05 为差异有统计意义。

结果

一、病例组与对照组一般特征比较

病例组与对照组在Ⅱ型糖尿病史分布差异无统计学意义（P＞0.05），在年龄、性别、高血压史、GLU、收缩压、舒张压、TC、TG、HDL-C、LDL-C 方面差异均具有统计学意义（P＜0.05）（表2）。因此，在分析rs12346650 和rs2505901 两个位点变异与HS 关联性时，调整上述指标。

二、rs2505901、rs12346650多态性与HS关联分析

总人群中病例组和对照组间rs2505901 和rs12346650 的基因型、等位基因型频率差异均无统计学意义（P＞0.05），校正混杂因素年龄、性别、糖尿病史、高血压史、TC、TG、HDL-C 和LDL-C 后，关联仍无统计学意义（表3）。

表2 病例组和对照组人群的一般特征比较

三、按性别分层分析

进一步按性别对两个位点与HS 的关联性进行分层分析，结果表明，男性人群中rs2505901 位点显性模型有统计学意义，比值比（odds ratio，OR）[95%置信区间（confidence interval，CI）]为0.641（0.417～0.984），P=0.041。rs12346650 位点相加模型和隐性模型均有统计学意义，OR（95%CI）分别为1.369（1.020～1.836）、2.092（1.243～3.520），P 值分别为0.036、0.005。但校正年龄、糖尿病史、高血压病史、TC、TG、HDL-C 和LDL-C 后，上述关联均无统计学意义（P＞0.05），具体信息见表4。

在女性人群中，校正协变量前后rs2505901 位点与HS 均无显著关联（P＞0.05）。rs12346650 位点与HS 关联有统计学意义，校正协变量后的隐性模型OR（95%CI）为0.318（0.114～0.891），P=0.029。

表3 rs2505901、2346650 单核苷酸多态性与出血性脑卒中的关联分析

表4 按性别分层分析结果

讨论

TGFBR1 主要介导TGF-β 对细胞外基质作用的信号，参与血管细胞外基质沉淀和血管重塑。TGFBR基因多态性与多种疾病均存在关联。已有研究表明TGFBR2 基因多态性与高年龄人群高血压患病风险增加显著关联，TGFBR1 基因多态性与贲门腺癌的发病密切相关，但是TGFBR1 基因多态性与脑卒中相关性的研究报道较少[10,11]。

本研究结果表明，在男性人群中，rs2505901 和rs12346650 两个位点均和HS 存在弱的关联，经过校正混杂因素后，关联未显示有统计学意义。而在女性人群中，校正混杂因素后rs12346650 位点与HS 存在关联，其隐性模型有统计学意义，OR（95%CI）为0.318（0.114～0.891），提示rs12346650 位点A等位基因型的突变在女性人群中对HS 可能具有保护性。

TGFBR1 定位在基因组9q22.33，包括9 个外显子共5600 bp。成熟的TGFBR1 大约由500 个氨基酸残基构成，包括N-末端的胞外配体结合区域和C-末端的丝氨酸/苏氨酸激酶活性区域，在胞内区域紧靠激酶活性区域的N 端侧有一段高度保守的特异性SGSGSG 序列，称为GS 区[12,13]。TGF-β1 不能和TGFBR1 直接作用，需要激活的TGFBR2 通过转磷酸化TGFBR1 的GS 区才能将其激活，受体复合物中TGFBR1 决定信号通路的性质。在肝癌细胞株HLE 和HLF 的研究中发现，TGFBR1 激酶抑制剂LY2109761 通过两种途径减少肿瘤血管的形成从而限制肝癌的发生发展：（1）减少血管的数目和弯曲度，这两者是肿瘤汲取氧气和疏散药物的形态学基础；（2）阻断微环境中肿瘤与机体的相互作用[14]。上述研究表明TGFBR1 可以影响血管的发育和重塑。

miRNA 是指长度约为21～25 个核苷酸，进化保守、内源性的非编码小分子RNA。miRNA 在调控许多蛋白质编码基因表达方面起着非常重要的生物学作用，其与mRNA 不完全互补配对时，会抑制翻译的过程；而与mRNA 完全互补配对时，则切割或降解mRNA[15]。生物信息分析结果显示，结合TGFBR1靶 基 因 的miRNA 只 有miR-938，miR-938 能 与TGFBR1 靶基因启动子区域结合从而抑制TGFBR1基因的转录调控TGFBR1 基因的表达。国内外关于miR-938 与心血管疾病的研究报道少见报道。

综上所述，本研究考虑了高血压作为HS 重要、独立危险因素对其发病的影响，同时还调整了年龄、性别、Ⅱ型糖尿病和血脂等因素的混杂作用，初步发现TGFBR1 基因rs12346650 及结合该基因的miR-938其基因rs2505901 多态性与HS 存在一定关联，提示参与血管发育重塑的生物学分子通路遗传变异可能参与了HS 发病的分子机制。有关研究结果将有待于其他人群研究进一步验证。