α-酮戊二酸的生物学功能及分子机制研究进展

魏易焓，张 姹，束 刚

（华南农业大学动物科学学院，广东省动物营养调控重点实验室，广东 广州 510642）

骨骼肌在收缩过程中可以释放多种肌肉因子（Myokines）和生物活性代谢中间产物（Myometabolites），通过自分泌、旁分泌和内分泌等方式调节动物机体活动。近年来大量研究发现，α-酮戊二酸（Alpha-Ketoglutaric Acid，AKG）是一种重要的肌肉代谢中间产物。在肌肉运动过程中，三羧酸循环和谷氨酸脱氨基反应均可以产生大量AKG。已有研究表明，AKG 在蛋白质合成[1-2]、骨骼肌的发育和代谢[3-5]、钙稳态[6]等方面均发挥着重要调节作用。本文简述AKG 的生理功能及其作用机制，为AKG 在畜禽生产和医药临床应用方面提供参考。

1 AKG 调节肌肉和骨骼发育

机体蛋白质的周转是影响动物生长发育和肌肉肥大的重要因素[7]。骨骼肌蛋白质的沉积主要取决于肌肉蛋白质合成和降解的平衡[8-9]。有研究表明，在肌肉萎缩模型的DMD 小鼠中添加AKG，可以促进蛋白质沉积，缓解蛋白质降解和肌肉萎缩症状[10]。有人医临床研究表明，将AKG 作为营养补充剂可显著促进术后患者的肌肉蛋白合成[11]。AKG 促进肌肉肥大的机制：一方面是通过激活Akt/mTOR 信号通路促进骨骼肌蛋白合成[12-13]；另一方面，还可以通过抑制叉头框O（Forkhead Box O，FoxO）家族蛋白的转录活性，进而降低MuRF1和MAFbx基因的表达，抑制蛋白质降解。进一步研究发现，AKG 对肌肉蛋白质周转的调控作用可能与脯氨酸羟化酶（Proline Hydroxylase，PHDs）有关。PHDs 是在低氧条件下表达的重要羟基化酶[14]，该酶可以通过羟基化靶蛋白，进而引起靶蛋白的泛素化和降解。本实验室研究发现，AKG 可以抑制PHD3 活性，维持骨骼肌中肾上腺素能受体β2 受体（Adrenergic Receptor，ADRB2）蛋白的稳定性，从而抑制蛋白质降解，防止肌肉萎缩[10]。

此外，骨骼肌分泌的AKG 还可以旁分泌的形式调控骨骼的发育和骨钙代谢。Andersen 等[15]研究表明，在仔猪日粮中添加AKG 3 周可明显提高仔猪的骨长度、皮质骨密度、最大弹性强度和极限强度。Tatara 等[16]研究发现，切除火鸡直肠神经会引起骨半径减少，而添加AKG 后能有效增加火鸡的体积骨密度、横截面积、平均相对壁厚、最大弹性强度和极限强度。也有研究表明，在羊羔日粮中添加AKG 2 周可显著增加骨质密度和骨最大弹性强度[17-18]。此外，有临床研究还发现，添加AKG 对人的骨组织有类似影响[19-20]。最近的一项研究表明[21]，肠内AKG 含量与雌激素水平升高有关，AKG对绝经后妇女在保持骨量和预防骨钙流失方面具有潜在的作用。已有研究表明，在成骨细胞[22]和破骨细胞[23]上有谷氨酸受体（Glutamate Receptor，GluR），AKG可通过谷氨酸与GluR 间的互作影响骨骼发育[24]。其次，AKG 可以促进胶原蛋白的合成，进而调节骨骼发育。AKG 可以通过脯氨酸参与胶原蛋白合成。脯氨酸作为胶原蛋白的主要成分，在胶原代谢中起着重要作用。研究表明，胶原蛋白中脯氨酸的羟基化在胶原蛋白螺旋结构的形成中至关重要[25-26]。AKG 是脯氨酸-4-羟化酶（Prolyl 4 Hydroxylase，P4H）的辅助因子，可以促进4-羟基脯氨酸的形成[27]。最近的一项研究表明[28]，AKG 可以诱导JNK、mTOR、S6K1 和S6 的磷酸化，激活JNK 和mTOR/S6K1/S6 信号通路，促进成骨细胞的分化。其中，JNK 信号通路[29-30]和mTOR 信号通路[31-32]均已被证实参与成骨细胞分化过程，mTOR 信号通路可以激活底物S6K1，促进细胞分化所需的蛋白质的合成[33]。

2 AKG 在调节细胞代谢方面的作用

AKG 是三羧酸循环的重要代谢中间产物。骨骼肌在收缩过程中释放的AKG 对细胞代谢具有重要的负反馈调节作用，从而可以延缓细胞寿命，调节糖脂代谢和肿瘤细胞代谢中发挥重要的作用。

AKG 可以调节微生物和动物的代谢水平，具有延长细胞寿命的潜力。Chin 等[34]研究发现，AKG 可以改善成年秀丽隐杆线虫因衰老引起的运动机能协调障碍，表明AKG 延长线虫寿命的机制主要与其抑制ATP 合成酶有关。线粒体ATP 合成酶是几乎所有活细胞能量代谢必须的关键酶[35-36]。研究表明，ATP 合成酶的β亚基（ATP-2）是一种新型的AKG 的结合蛋白，AKG 可以通过直接结合ATP-2，抑制相关的酶，使ATP 水平和耗氧量降低，从而延长成年秀丽隐杆线虫的寿命。Su 等[37]研究表明，AKG 可使果蝇的平均细胞寿命延长8%，最高延长15%，这一过程主要通过激活AMP 活化蛋白激酶（AMP Activated Protein Kinase，AMPK）信号和抑制雷帕霉素靶蛋白（Mammalian Target of Rapamycin，mTOR）通路达到延长果蝇细胞寿命的效果。一方面，AKG 可以刺激蛋白激酶A（Protein Kinase A，PKA）的表达，进而通过增强LKB1基因的表达激活AMPK。另一方面，AKG 可以抑制mTOR 通路相关基因（如TORC、PI3K）的表达，同时增加与自噬过程相关的基因（如TEEB、Atg）的表达，从而达到抑制蛋白质合成和细胞增殖，增加自噬的作用。

AKG 可以通过多种途径调节糖脂代谢，改善胰岛素敏感性、促进脂肪组织燃烧和分解，从而在预防肥胖和糖尿病等代谢性疾病中起积极作用。Tekwe 等[38]研究表明，AKG 可以通过抑制磷酸酰胺转移酶（GFAT）催化合成葡萄糖-6-磷酸的过程以及诱导降低血浆中亮氨酸浓度的途径，促进内皮细胞（Endothelial Cells，EC）合成一氧化氮（Nitric Oxide，NO），从而改善胰岛素的敏感性，缓解机体心血管功能障碍。此外，AKG 还可通过表观遗传和内分泌机制促进脂肪代谢。Yang 等[39]研究表明，褐色脂肪中的AKG 可以与Tet蛋白酶结合，促进Prdm16 启动子发生DNA 去甲基化，同时激活AMPK，共同促进脂肪褐色化。Yuan 等[40]的最新研究也发现，AKG 可以通过膜受体OXGR1 的介导刺激肾上腺素的释放，进而增加褐色脂肪代谢和白色脂肪的脂解。

此外，AKG 还可以抑制肿瘤细胞代谢和恶性发展。Morris 等[41]研究发现，AKG 介导了抑癌基因p53对肿瘤细胞恶性发展的抑制作用；对于p53 缺陷型肿瘤细胞，AKG 的积累还可以重新调整肿瘤细胞的代谢，促进肿瘤细胞的分化并抵抗恶性肿瘤细胞增殖，结果表明p53基因的失活一定会导致肿瘤细胞向癌细胞转变，当恢复p53 缺陷型肿瘤细胞中的p53基因活性时，AKG/琥珀酸的比值增加，AKG 的积累使AKG 依赖性染色质修饰5´-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）水平增加，促进DNA 去甲基化，实现p53 引发肿瘤细胞的分化。反之，用AKG依赖性双加氧酶竞争性抑制剂使AKG/ 琥珀酸的比值降低，则会减弱p53 抑制肿瘤细胞癌变的能力。

3 AKG 在调节免疫和炎症方面的作用

T 淋巴细胞亚群是动物机体细胞免疫的重要组成部分。原始T 细胞可以分化成不同亚群，其中效应T细胞（Effector T Cells，Te）具有释放淋巴因子的功能；调节性/ 抑制性T 细胞（Regulatory/suppressor T Cells，Tr）具有抑制细胞免疫及体液免疫的功能[42-44]；辅助性T 细胞（Helper T Cells，Th）具有协助体液免疫和细胞免疫的功能。有研究表明，AKG 在T 细胞的分化去路中发挥着重要的调节作用[45-51]。Klysz 等[45]研究表明，在去除谷氨酰胺的小鼠中添加可渗透入细胞的AKG 衍生物——α-酮戊二酸二甲酯（Dimethyl AKG，DMK），在细胞中出现了大量的Tbet 转录因子，而Foxp3 阳性细胞的生成减少。其中，Tbet 是生成Th1亚群细胞所需的关键转录因子，Foxp3 阳性细胞可形成大量Tr 亚群，发挥抑制免疫的功能。此外，原始T 细胞向Th1 的分化依赖于mTOR 信号通路[46-47]，若抑制mTOR 活性，则会促进原始T 细胞分化为Tr 细胞亚群，反之亦然[48-50]。研究发现，T 细胞内AKG 的增加提高了mTOR 信号，促进初始T 细胞向Th 转化，促进免疫机能的发挥[51]。此外，AKG 可以调节T 细胞分化的机制还与表观遗传学修饰状态有关。AKG 依赖的蛋白酶Tet2 可与AKG 共同作用，催化5-甲基胞嘧啶（5-mC）转化为5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC），后者可以促进DNA 去甲基化，促进原始T 细胞分化成熟。若Tet2缺乏，会抑制原始T 细胞分化为Th1，使免疫机能降低。

除T 细胞外，巨噬细胞总量的增加和M1/M2 巨噬细胞比例通常也是组织发生炎症的重要标志。已有研究表明，三羧酸循环及其内源性代谢物在调节脂肪组织的炎症中发挥着关键作用[52]。Liu 等[53]研究表明，在饲喂高脂日粮的小鼠模型中添加褪黑素，可以提高脂肪细胞线粒体中的异柠檬酸脱氢酶2（Isocitrate Dehydrogenase 2，IDH2）的水平，促进AKG 水平增加。AKG 可以外泌体的形式转运到巨噬细胞，与Tet 蛋白酶结合共同介导DNA 去甲基化，降低了M1/M2 巨噬细胞的比例，缓解脂肪细胞炎症。此外，多数炎症通路都可以激活NF-κB 信号通路以增强炎症反应。外泌体AKG 还可以通过oxoglutarate 受体1（OXGR1）减弱脂肪细胞中STAT3/NF-κB 信号，进而缓解脂肪炎症[54]。该研究为外泌体途径运输代谢物，用以治疗与肥胖相关的代谢性疾病提供新的策略。

4 AKG 在干细胞发育中的作用

干细胞是来自于胚胎、胎儿或成体内可以在一定条件下进行无限次自我更新与增殖分化的一类细胞，在治疗疾病和修复创伤中具有广泛的应用前景。已有研究表明[55-58]，AKG 在促进胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells，ESCs）和成体干细胞的增殖与分化中发挥着重要作用。胚胎干细胞可以分为原始态多能干细胞和始发态多能干细胞，虽然原始态和始发态多能干细胞都具有分化成其他成体细胞的能力，但原始态多能干细胞在发育链上位于更早期的位置，分化的灵活性强，分化为特定细胞和组织的偏向性小，在再生医学方面具有更高的应用价值。Carey 等[55]研究表明，在没有添加外源谷氨酰胺的条件下，模拟内细胞团外胚层细胞表型的无血清培养基中的小鼠ESCs 与传统血清培养基中的小鼠ESCs相比，仍然可以大量增殖，保持ESC 形态和多能性的特征，产生大量AKG，并且小鼠ESCs 通过调节自身的代谢，抑制AKG 生成琥珀酸盐，促进AKG 与Tet 蛋白酶结合，共同作用催化5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）的生成，诱导DNA 去甲基化，进而激活与保持干细胞多能性有关的基因表达，促进原始态多能干细胞的增殖，而抑制分化，使小鼠ESCs 保持多能性；此外，向传统血清培养基中添加AKG 可以使传统血清培养基中的小鼠ESC 变得更接近无血清培养基中的小鼠ESCs[55]。与小鼠ESCs 不同，人类的胚胎干细胞属于始发态多能干细胞。TeSlaa 等[56]研究表明，在始发态人类多能干细胞（human Pluripotent Stem Cells，hPSCs） 中增加AKG 或AKG/ 琥珀酸的比例可以诱导组蛋白与DNA发生去甲基化，促进始发态多能干细胞的分化。以上研究表明，AKG 既可以增强与保持DNA 和组蛋白低水平甲基化有关的酶活性，从而维持原始态多能干细胞的自我更新状态，同时还可以促进表观基因组重构，诱导始发态多能干细胞分化。

成体干细胞存在于机体的各种组织器官中，多处于休眠状态。在特定条件下，成体干细胞能够进行自我更新，并分化成该类型组织的细胞。Song 等[57]研究表明，在胰腺干细胞中添加AKG，可以增强干细胞有关基因的表达，上调干细胞增殖标记物，促进胰腺干细胞的增殖；进一步研究发现，在添加AKG 的胰腺干细胞中，Tet 蛋白酶的表达量上升，5-甲基胞嘧啶（5-mC）的表达量下降，与干细胞增殖相关的基因CyclinD1发生去甲基化，表明AKG 促进胰腺干细胞增殖的机制是通过与Tet 蛋白酶共同作用诱导DNA 去甲基化实现的。同理，Tischler 等[58]研究也表明，在原始生殖细胞样细胞（Primordial Germ Cells-Like Cells，PGCLCs） 中添加AKG，Tet1 的表达量显著上升，组蛋白去甲基化酶的活性也提高，从而促进PGCLCs 分化为精子和卵子。Yang 等[59]研究表明，敲除Tet1 和Tet2 蛋白酶会阻断DNA 的去甲基化，进而导致骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMMSCs）的自我更新和分化能力受损，破坏骨髓稳态，敲除Tet1 和Tet2蛋白酶还降低了BMMSCs 中5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）的水平，这与AKG 与Tet 蛋白酶共同促进DNA 去甲基化的过程表现相似。上述结果均提示，AKG 可能促进BMMSCs 的更新与分化，从而维持BMMSCs 的功能。

5 展 望

综上，AKG 可以通过复杂的信号通路调节肌肉和骨骼发育、细胞代谢、免疫炎症和干细胞发育等生理过程，这些进展对于畜牧生产和人类临床医学领域应用AKG 具有重要的借鉴价值。虽然对AKG 的营养生理学功能研究已经取得了重大突破，但何种运动方式产生的AKG 水平更高，AKG 在细胞外、细胞浆和线粒体内的感应机制是否相同等诸多问题尚未解决，均有待于进一步深入研究。