TPO、HBME-1、CK19、Galectin-3、CyclinD1检测在甲状腺良恶性病变中的鉴别诊断价值

周艳，罗枫，伍世钢，阮君

广州医科大学附属第六医院(清远市人民医院)病理科，广东 清远 511518

随着人们健康体检意识的提高及超声诊断技术的进步，发现甲状腺小结节而进行手术的病例逐年增加，而甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)是最常见的甲状腺恶性肿瘤。对甲状腺手术标本中进行病理检查，因病变微小或形态学不典型，仅仅通过常规HE染色进行病理诊断具有一定的困难。淋巴结转移是PTC局部复发的主要因素，淋巴结转移将增加治疗的难度。为了进一步诊断疾病、判断预后，本研究观察了免疫组化法检测甲状腺过氧化物酶(TPO)、间皮细胞(HBME-1)、细胞角蛋白19(CK19)、半乳糖凝素-3(Galectin-3)、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)在PTC与良性病变中的表达水平，探讨其在PTC与良性病变鉴别诊断中的价值以及CyclinDl与PTC淋巴结转移间的关系，为诊断及预后提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集清远市人民医院2012—2018年甲状腺手术病例(甲状乳头状癌和甲状腺良性病变)533例，均由两名主治医师以上职称的病理诊断医生根据WHO诊断标准进行诊断。533例病例中包括甲状乳头状癌(PTC)269例(其中乳头状微小癌103例)，年龄14～79岁，中位年龄44岁；女性220例，男性49例；单侧PTC231，双侧PTC 36例，单侧合并峡部PTC 2例。余264例为病理组织形态学需与PTC鉴别的甲状腺良性病变(BTL)(出现局部滤泡上皮乳头状增生，滤泡上皮细胞具有非典型性)。其中包括甲状腺滤泡增生162例，滤泡性腺瘤81例，桥本甲状腺炎21例(桥本合并PTC 7例，滤泡性腺瘤合并PTC 3例)。PTC行TPO、CK19、HBME-1标记269例，CyclinD1标记205例，Galectin-3标记209例。良性甲状腺病变TPO、CK19标记 264例，HBME-1标记253例，CyclinD1标记201例，Galectin-3标记202例。

1.2 研究方法 取石蜡包埋组织，然后进行切片，其厚度为3 μm；其中一张切片行HE染色，其余切片进行免疫组织化学检测。免疫组化采用EnVision二步法，DAB显色，苏木精复染。用已知的阳性切片作阳性对照。用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照。

1.3 观察指标与判定标准 观察TPO、CK19、HBME-1、Galectin-3、CyclinD1在甲状腺乳头状癌与甲状腺良性病变组织中的表达。由两名以上主治医师及以上职称的病理诊断医师进行结果判读。阳性表达判定标准：TPO、CK19胞膜及胞浆出现棕黄色颗粒为阳性细胞，Galectin-3胞浆着色，HBME-1胞膜着色，CyclinD1胞核着色。按阳性细胞所占百分比判断，TPO、HBME-1、CK19、Galectin-3、CyclinD1阳性细胞大于10%为阳性，否则为阴性。

1.4 统计学方法 应用SPSS19.0统计学软件分析数据，两组间率的比较采用χ2检验，均以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者的五种检测标记物比较 PTC组的HBME-1、CK19、Galectin-3、CyclinD1阳性表达率明显高于甲状腺良性病变组，而TPO阳性表达率明显低于甲状腺良性病变组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 5个指标在乳头状癌与良性病变中的表达情况［例(%)]

在免疫组化切片TPO在PTC中呈阴性或局灶弱阳性，正常甲状腺呈强阳性，良性病变中多呈中-强阳性。HBME-1在PTC多呈细胞膜连续性的中-强表达，在良性病变中阴性或局部弱阳性。CK19、Galectin-3在PTC多呈强表达，在良性病变中多呈阴性，部分良性病变弱-中度或局灶的强表达。CyclinD1在多数PTC病例中呈核弥漫着色，在良性病变中多数呈局部核着色。TPO乳头状癌阴性表达，桥本甲状腺炎阳性表达(图1)。HBME-1乳头状癌阳性表达，桥本甲状腺炎阴性表达(图2)。CyclinD1乳头状癌阳性表达(图3)。CK19乳头状癌阳性表达(图4)。

图1 TPO左下乳头状癌阴性表达，右上桥本甲状腺炎阳性表达(×40)

图2 HBME-1左下乳头状癌阳性表达，右上桥本甲状炎阴性表达(×40)

图3 CyclinD1在乳头状癌阳性表达(×40)

图4 CK19在乳头状癌阳性表达(×40)

2.2 淋巴转移与无转移组患者的CyclinD1比较 CyclinD1标记PTC 205例，淋巴结转移组55例，无淋巴结转移组150例。有淋巴结转移组和无淋巴结转移组患者的CyclinD1表达水平分别为92.7%(51/55)、88.0%(132/150)，差异无统计学意义(χ2=0.55，P＞0.05)。

2.3 标记物的灵敏度、特异性、准确度 TPO、HBME-1、CK19、Galectin-3、CyclinD1在PTC诊断的灵敏度、特异性、准确度、阳性预测值和阴性预测值见表2。其中TPO特异性和阳性预测值最高。CK19、Galectin-3灵敏度和阴性预测值最高，TPO、HBME-1、Galectin-3均表现较高的准确度。

表2 5种标记物的灵敏度、特异性、准确度、阳性预测值、阴性预测值比较(%)

3 讨论

近年来，甲状腺乳头状癌发病趋势呈全球化激增，其中甲状腺乳头状微小癌所占比重逐渐上升[1]。PTC的诊断主要是依据病理形态学肿瘤细胞核的特点，包括毛玻璃样核、核沟和核内假包涵体，还可出现间质纤维组织反应、钙化及砂粒体。然而很多早期PTC形态学不典型，甲状腺乳头状微小癌≤1.0 cm，有些病变甚至小于0.2 cm，无典型乳头状结构，镜下仅表现为大量胶原纤维中分布着散在的滤泡结构，细胞异型性不明显，给PTC的诊断提出了很高的挑战和要求。在良性甲状腺病变中亦可见到乳头状增生的上皮或是丰富密集的滤泡，出现细胞的不典型性，核增大、毛玻璃样核、核沟等。因此部分病例单纯从病理形态学方面来鉴别甲状腺良恶性存在一定困难。

TPO是一种糖基化血红素蛋白，主要存在于甲状腺滤泡细胞游离面，是甲状腺激素合成通路中的重要物质，在T4和T3合成中起重要的催化作用。TPO基因的一些突变可能与甲状腺癌的发生有关。本研究发现通过免疫组化方法检测TPO在正常甲状腺组织中表达，而在PTC中为阴性或弱阳性，在良性病变中多呈现中等至强阳性表达。在PTC中TPO表达缺失达84.0%，在良性病变仅6.1%缺失，差异有统计学意义，与文献中报道一致[2-3]。本研究TPO的特异度达93.94%，阳性预测值达93.39%。有报导认为TPO阴性表达是PTC诊断的可靠依据[4]。人骨髓内皮细胞标记物(HBME-1)为单克隆抗体，是间皮细胞微绒毛表面特异性标记物，在肿瘤血管的形成、肿瘤的生长以及肿瘤的转移中发挥重要作用。以往常被用于间皮来源肿瘤的诊断，但是近些年被用于PTC的诊断中。HBME-1在PTC中高表达，在良性病变中不表达或局灶表达，对PTC灵敏度、特异性均较高，与文献报道一致[5]。HBME-1阳性表达对PTC的确诊具有重要意义[6-7]。CK19是一种低分子量上皮标记，主要存在于单层上皮中。近来应用于PTC的诊断中。本研究发现CKl9诊断PTC的灵敏度最高，与文献[8]中报导一致。CK19在PTC表达的阳性率为100.00%，且均为弥漫强阳性，在良性病变的阳性率为44.3%，多为局部阳性。CK19对PTC和良性病变的鉴别诊断灵敏度最高100.00%，但特异性最低仅55.56%。CK19的阴性预测值为100.00%，因此有研究[9]认为CK19阴性基本可除外PTC的诊断。Galectin-3是一种和β-半乳糖苷结合的内源性凝集素，在细胞与细胞、细胞与基质之间起特异性黏附作用。具有多种生物学功能，如参与前mRNA剪接、细胞生长调控、细胞粘附、炎症反应、细胞凋亡，与肿瘤恶性转化、肿瘤转移有密切关系[10]。本实验显示Galectin-3在PTC中多呈阳性，在良性增生病变阴性或局部阳性，与文献报导一致[11]。Galectin-3鉴别甲状腺良恶性肿瘤灵敏度为98.56%。有研究将免疫组化应用于甲状腺细针穿刺标本，发现Galectin-3和CK19也诊断PTC最敏感的标记物[12]。甲状腺乳头状癌组CyclinDl蛋白表达高于甲状腺良性病变组，提示细胞增殖在甲状腺恶性肿瘤中增快。有早期观察发现出现转移的PTC其独特的免疫组织化学表型为p27表达的缺失及cyclin D1的高表达,cyclin D1阳性表达等因素是PTC出现淋巴结转移和预后较差的危险因子[13]。此外，也有一些研究发现CyclinDl蛋白的表达与PTC淋巴结转移无明显关联性[14-15]，与本实验结果一致。因文献报导不尽相同，待下一步更大样本量及更多临床病理因素的分析。有大量观察显示PTC出现颈部淋巴结转移的高危因素包括：男性、发病年龄＜45岁、肿瘤大小＞5 mm、甲状腺外浸润、双侧病变、多灶性、BRAF(V600E)突变、人类端粒酶逆转录酶(hTERT)突变阳性、病理分期3期/4期[16]。

本研究应用免疫组化技术，发现PTC组患者TPO、HBME-1、CK19、Galectin-3、CyclinD1的阳性表达率与B TL组患者比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)；TPO、HBME-1、CK19、Galectin-3、CyclinD1用于PTC诊断时的灵敏度分别是84.01%、86.62%、100.00%、98.56%、89.26%，特异性分别是93.94%、86.56%、55.56%、73.76%、71.14%；CyclinD1在淋巴结转移组的阳性率与无淋巴结转移组的阳性率比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。以上研究结果说明TPO、HBME-1、CK19、Galectin-3、CyclinD1在PTC与良性病变中的表达差异显著，认为免疫组化技术是诊断PTC非常必要的手段。

综上所述，PTC的诊断及鉴别诊断中，在病理组织形态学的基础上，检测TPO、HBME-1、CK19、Galectin-3、CyclinD1可提高PTC的确诊率，有效避免漏诊及误诊。