黑曲霉发酵产柚苷酶的工艺优化及热激对提高酶活的影响

李 坤 峰， 孙 西 同， 李 佥， 石 峰，徐 杰， 罗 健， 田 晶， 费 旭

( 1.大连工业大学 生物工程学院， 辽宁 大连 116034；2.中国科学院大连化学物理研究所， 辽宁 大连 116023；3.大连工业大学 实验仪器中心， 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

柑橘类饮料目前在市面上较为常见，而在加工生产时会遇到一个难题，果汁中会产生一种独特的苦味，在一定程度上影响其品质和风味，这种主要的苦味物质是柚皮苷[1]。去除苦味的方式很多，较为常见的是采用柚苷酶进行生物降解处理，目前工业化生产的酶制剂过程复杂且价格昂贵，阻碍了一系列的产业发展。有相关文献报道，柚苷酶目前主要由微生物发酵获得，国内外关于柚苷酶的研究也主要集中在发酵菌株筛选[2-3]、发酵相关条件优化[4-5]和酶的分离纯化[6-7]等方面。

通过FDA安全认证的黑曲霉是主要的生产菌，目前通过发酵生产的柚苷酶酶活依旧处于较低水平，少数较高的酶活水平也处于实验室阶段，工业化生产方面有很大的提升空间。有相关研究表明，热激是可能会增高酶或部分代谢产物的有效策略[8-9]，突增温度会影响菌体内部代谢，进而可能改变酶的代谢水平，但目前关于热激提高黑曲霉发酵产柚苷酶的相关研究较少。本实验利用自主保藏的多株产柚苷酶的菌株进行筛选并进行初步发酵工艺研究，在最优发酵条件下研究热激对提高柚苷酶发酵酶活的影响，以期为探索并建立柚苷酶高效发酵生产技术提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

黑曲霉FFCC uv-11、米曲霉FFCC 3102、黑曲霉FFCC 3111、黑曲霉FFCC 3112、黑曲霉FFCC 848、黑曲霉FFCC 48，均由大连工业大学菌种保藏中心提供；柚皮苷(w≥98%)，宝鸡市方晟生物开发有限公司；脱脂豆粉，大连调味食品厂；其他化学试剂均为分析纯。

斜面培养基(g/L)：硫酸铁0.01，磷酸氢二钾1.0，磷酸二氢钾1.0，硝酸钠3.0，硫酸镁0.5，氯化钾0.5，蔗糖30.0，琼脂30.0，柚皮苷2.0，pH 6.0；121 ℃灭菌20 min。

发酵培养基(g/L)：硫酸镁0.5，硫酸铵4.0，硫酸锌0.09，磷酸氢二钾1.5，磷酸二氢钾1.5，氯化钙0.1，豆粉2.0，蛋白胨2.0，酵母浸粉1.0，柚皮苷6.0，初始pH 6.0，121 ℃灭菌20 min。

1.2 方 法

1.2.1 高产柚苷酶菌株的筛选

将真菌种子液按10%接种量接种到30 mL培养基中，在30 ℃、180 r/min摇床中进行发酵培养，在发酵96 h时测定柚苷酶酶活，进行复筛。

1.2.2 高产柚苷酶菌株发酵条件优化

1.2.2.1 发酵时间的确定

在30 ℃、180 r/min摇床发酵培养菌株，分别在0、24、48、72、96、120、144 h取样测定酶活。

1.2.2.2 接种量的确定

分别按4%、7%、10%、13%、16%的接种量接种到培养基中，在30 ℃、180 r/min摇床发酵培养至最佳发酵时间，测定酶活。

1.2.2.3 初始pH的确定

分别配制不同初始pH(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)的发酵培养基，按最佳接种量接种到30 mL发酵培养基中，在30 ℃、180 r/min摇床发酵培养至最佳发酵时间，测定酶活。

1.2.3 热激工艺优化

1.2.3.1 热激温度的确定

分别以不同的温度(35、40、45和50 ℃)刺激60 min，在30 ℃下培养至最佳发酵时间，发酵结束检测酶活、生物量和pH。

1.2.3.2 热激时间的确定

在最优发酵条件下培养至指数生长期，选择不同时间点(12、18、24、30和36 h)，分别以最佳温度热激60 min，在30 ℃下培养至最佳发酵时间，发酵结束检测酶活、生物量和pH。

1.2.3.3 热激时长的确定

在其他最佳条件下分别热激处理不同时长(30、60、90和120 min)，在30 ℃下培养至最佳发酵时间，发酵结束检测酶活、生物量和pH。

1.2.4 柚苷酶活性的测定

将1.6 mL的0.8 mg/mL柚皮苷溶液和0.4 mL 粗酶液混合均匀，在50 ℃的条件下反应0.5 h。取0.2 mL反应酶解液，加入10 mL 90%一缩二乙二醇和0.2 mL 4 mol/L的NaOH溶液，摇匀后放置约15 min，测定溶液420 nm处的吸光度。

柚苷酶活力单位定义：在pH 4.5、50 ℃的条件下，1 min水解1 μg的柚皮苷所需的酶量为1个酶活力单位(U/mL)。

1.2.5 生物量的测定

将发酵液倒入50 mL离心管，冷藏温度下5 000 r/min进行离心20 min，取上清液用于测定柚苷酶活力，倒去多余上清液，用纯化水洗涤菌体沉淀3次后，置于105 ℃烘箱烘干至恒重，称重并计算生物量。

1.2.6 数据分析

每组进行3次平行实验，利用Origin进行数据分析并绘图。

2 结果与讨论

2.1 高产柚苷酶菌株的筛选

将6种真菌进行摇瓶发酵产酶，测得其发酵酶活的结果见如图1。由图分析可明显发现黑曲霉uv-11的发酵酶活最高，均高于其他菌株，酶活达到431.30 U/mL。最终确定黑曲霉uv-11为高产柚苷酶的实验菌。

2.2 高产柚苷酶菌株的发酵工艺优化

由图2(a)可以看出，在发酵120 h时酶活达到最高，但随后又略有下降，可能发酵时间过长导致的环境影响了酶的活性[10-11]，因此确定最佳的发酵时间为120 h。图2(b)可以看出，接种量为10%时柚苷酶酶活最大。曲霉菌产酶的最适pH为5.4～6.4，由图2(c)可以看出，当初始pH为6.0时，最终发酵酶活达到最大。此最佳发酵工艺条件下的柚苷酶发酵酶活达到765.85 U/mL。

图1 6种黑曲霉菌株的酶活比较

(a) 发酵时间

(b) 接种量

(c) 初始pH

图2 柚苷酶发酵工艺优化

Fig.2 Optimization of fermentation conditions of naringinase

2.3 热激工艺优化

2.3.1 热激温度

如图3所示，柚苷酶酶活随温度升高逐渐提高，35 ℃时达到最大，与对照组相比酶活提高了13.89%左右；当热激温度进一步增大，酶活逐渐降低，说明热激温度过高不仅不利于酶活的提高，还可能导致柚苷酶性质不稳定甚至失活。高温胁迫产生一系列热激蛋白等分子会促进相关蛋白的正确折叠表达[12]，对于提高酶产量或酶活起到重要作用。温度的升高导致发酵终点pH的降低和过高的生物量，过高温度会影响其正常的代谢，不利于菌株产酶。确定35 ℃为最适热激温度。

图3 热激温度对柚苷酶活性、生物量和发酵终点pH的影响

Fig.3 Effects of heat-shock temperature on naringinase activity, biomass and terminal pH

2.3.2 热激时机

如图4所示，在12 h进行热激，其柚苷酶酶活明显低于其他实验组，说明指数前期的热激效果作用不明显。在30 h时热激，柚苷酶酶活最高。不同热激时机对发酵最终pH与生物量也没有明显影响。综合考虑30 h为最佳热激时机。

图4 热激时机对柚苷酶活性、生物量和发酵终点pH的影响

Fig.4 Effects of heat-shock time on naringinase activity, biomass and terminal pH

2.3.3 热激时长

如图5所示，在热处理30 min后发酵酶活最高，但随着热激时长的增加，柚苷酶发酵酶活逐渐降低，这说明热激时长的增加不利于提高发酵酶活，并可能会使细胞受热过度导致损伤[8]。热激时长对发酵最终pH和生物量的影响不大，因此确定30 min为最佳热激时长。

图5 热激时长对柚苷酶活性、生物量和发酵终点pH的影响

Fig.5 Effects of heat-shock duration on naringinase activity, biomass and terminal pH

2.4 验证实验

在黑曲霉发酵最佳条件下进行验证实验，结果如图6所示。结果表明，经过热处理后实验组的发酵酶活(970.90 U/mL)是对照组的1.27倍，最终pH和生物量差距不大。

图6 热激处理前后柚苷酶活性、生物量和发酵终点pH的比较

Fig.6 Comparison of naringinase activity, biomass and terminal pH before and after heat-shock treatment

3 结 论

对AspergillusnigerFFCC uv-11进行产酶最佳的发酵工艺条件优化，柚苷酶发酵酶活达到765.85 U/mL。进一步探究了热激对该菌发酵产柚苷酶的影响，通过实验确定最佳热激条件：热激温度35 ℃，时间30 h，热激时长30 min，在此条件下柚苷酶酶活达到970.09 U/mL，是初始酶活(765.85 U/mL)的1.27倍。