FOXK1基因的生物特性及其在肿瘤中的研究进展

李 燕，陈 瑜，何美芝，卞小慧，涂令境，崔春晖，谢 朗南方医科大学珠江医院普通外科，广东 广州 508；南方医科大学第二临床医学院，广东 广州 5055

在人口结构老龄化、不良的饮食习惯、环境污染等众多因素的影响下，恶性肿瘤的发病率呈现逐年上升的趋势。近年来FOXK1基因在肿瘤中的作用受到广泛的关注，有证据显示FOXK1在多种细胞的生命活动以及肿瘤的发生、发展过程中扮演了重要角色。有一项关于生物信息学表达的分析表明FOXK1在幼儿脑、眼睛、心脏、肺脏和胸腺的低分化组织表达；而在成年人，FOXK1主要表达于恶性组织，尤其是脑、结直肠和淋巴结肿瘤[1]。本文关注FOXK1基因从第一次报道（1994年）到现在20多年间在肿瘤的研究进展，对FOXK1在各类肿瘤中的表达及作用作一综述。

1 FOXK1基因的特征

1.1 FOXK1基因的结构特点

自果蝇fork head基因被发现以来[2]，已经在不同物种中发现了许多FOX家族基因。人类叉头框（FOX）家族为一种转录因子家族，包含从A到Q的17个亚族、43个成员，其中FOXA-G、I-L和Q属于1类FOX亚型，FOXKH及M-P属于2类FOX亚型[3]。人类FOXK1基因属于FOX家族成员，因其编码的蛋白与小鼠肌细胞核因子/FOXK1具有高度同源性而得名。FOX蛋白也被称作翼状螺旋蛋白，FOX家族蛋白含有DNA结合区和转录调节区，其中DNA结合区又称“叉头区”，为各FOX家族亚型的共性结构，约含有100个氨基酸[4]。人源性FOXK1基因位于染色体7p22，包含13个外显子（图1）。FOXK1a和FOXK1b为FOXK1的两种转录物变体，它们的5’末端含有一个叉头框结构，可作为序列特异性DNA结合区域起作用以调节基因转录[1]。FOXK1蛋白核心部分为相连的3个α螺旋结构，两侧通过β链连接了两个称之为“翼”的环状结构（图2）。

1.2 FOXK1的蛋白特性及其分布

人源FOXK1蛋白由733个氨基酸排列组成，共约75.5 kDa，其中88.7%的氨基酸序列与鼠源FOXK1同源，48.7%的氨基酸与人FOXK2同源，47.5%氨基酸与非洲蟾蜍FOXK2同源。FOXK1a和FOXK1b蛋白富含丙氨酸、脯氨酸和丝氨酸，均有相同的叉头域及潜在的核定位信号（PKRR）。FOXK1在胎儿的脑、眼睛、心脏、肺和胸腺表达，成年人FOXK1主要在恶性组织表达，尤其是脑、结直肠和淋巴结肿瘤[1]。通过RNA测序、基因芯片和基因表达的系列分析显示的FOXK1基因在人体各个组织中的表达（图3）。另外，来源于HPA的亚细胞定位显示（图4），FOXK1蛋白高表达于细胞核，同时在细胞骨架中亦有中等量表达。

图1 人源性FOXK1基因的染色体定位

图2 FOXK1的蛋白结构

2 FOXK1基因的生物学功能

2.1 FOXK1调控细胞周期

FOXK1的敲除消除了细胞周期依赖性振荡并导致细胞增殖率降低，从而肯定FOXK1可作为细胞周期的重要调节分子[5]。FOXK1调节小鼠肌原性祖细胞（MPC）中细胞周期进程和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21，FOXK1的缺乏导致p21表达上调，使生长促进条件下MPC群中的G0/G1停滞[6]，这基本阐明了FOXK1作为癌基因影响细胞周期的一项重要作用机制。此外，FOXK1可直接抑制基因表达激活因子FOXO4的转录活性，从而降低其下游包括p21等靶基因，FOXO4的抑制作用导致MPC中p21表达降低，细胞增殖增加[7]。FOXK1可抑制结直肠癌细胞系SW480凋亡，实验发现在FOXK1基因高表达癌细胞SW480中，细胞生长增殖旺盛，而在敲除FOXK1基因的SW480细胞细胞周期状态大都停滞于的G0/G1期，未能进一步进展的SW480分裂期细胞进入细胞凋亡期[8]。此外，研究发现FOXK1还参与PLK1-FOXK1-JLP-JNK/p38/MAPK信号通路，与原癌基因PLK1相互识别、作用，促进了其在胞内的磷酸化和转录水平，介导细胞从G2期到M期的周期过程，从而参与有丝分裂[9]。

图4 FOXK1基因的亚细胞定位

2.2 FOXK1介导信号通路

FOX家族成员可通过转录调控和信号转导途径在机体的生长发育、细胞分化、代谢、凋亡以及免疫等方面起关键作用。Wnt/β-catenin通路是指导细胞增殖、自我更新、分化、组织稳态和胚胎发育的重要信号通路[10]。DVL相关蛋白在人类结直肠癌组织高表达，激活Wnt/β-catenin信号通路调控成人组织稳态发展和维持生物过程[11]。β-catenin调节Wnt信号通路的重要组成成分（cyclin-D1、c-myc和基质金属蛋白酶-7）的表达，导致细胞增殖和侵袭失控。FOXK1可以依赖于β-catenin，将DVL蛋白转位进入核内从而正向调控Wnt/β-catenin信号通路，在结直肠癌中发挥积极作用[12]。FOXK1还参与了Akt/mTOR信号通路调节miR-646介导的上皮间质转化（EMT）[13]。FOXK还被证实了可介导胚胎中肠内胚层的TGF-β信号通路，而TGF-β信号也可通过Smad/Mad结合位点直接调节FOXK的表达，形成反馈调节机制[14]。除此之外，FOXK1在各系统肿瘤中的作用还涉及多个信号通路，FOXK1在肿瘤中的表达及具体调控机制（表1）。

2.3 FOXK1与其他基因相互作用

进一步通过STRING筛选出了25种FOXK1相互作用蛋白。蛋白质互相作用的网络分析（图5）。FOXK1如何调控相关蛋白的表达并发挥其作用有待进一步探讨。

3 FOXK1与各系统肿瘤

3.1 FOXK1基因与卵巢癌

在不影响细胞凋亡的情况下，FOXK1过表达可显著提高S期细胞百分率，通过促进G1/S相变促进细胞增殖。同时，在卵巢癌细胞系中敲除FOXK1，细胞侵袭标志物MMP-9的表达降低。且FOXK1与细胞周期抑制蛋白p21的启动子区域存在相互作用，FOXK1的过表达抑制了p21的表达，表明FOXK1通过抑制p21转录促进细胞增殖[15]。

3.2 FOXK1基因与肺癌

CCK8和transwell侵袭实验表明，miR-1275可抑制肺癌细胞的增殖和侵袭，而FOXK1是miR-1275的一个潜在靶点，且miR-1275的过表达抑制了肺癌细胞中FOXK1的mRNA和蛋白水平[16]。这表明miR-1275可以调控肺癌细胞中FOXK1的表达抑制肺癌细胞增殖。进一步实验表明，circMAN2B2是通过circMAN2B2/miR-1275/FOXK1信号通路在肺癌中发挥致癌作用的。

3.3 FOXK1基因与弥漫大B细胞淋巴瘤

基于微阵列基因表达谱的弥漫性大B细胞淋巴瘤潜在关键基因的鉴定中预测FOXK1为抑癌基因miR-17-5p的靶向基因，参与DNA结合FOXK1最有可能通过靶向miR-17通过调节细胞生长和细胞凋亡在弥漫性大B细胞淋巴瘤的进展中起主要作用[17]。

表1 FOXK1在各种肿瘤中的表达及可能机制

3.4 FOXK1基因与前列腺癌

FOXK1在人前列腺癌细胞系中有高表达，其下调抑制了前列腺癌细胞的增殖和迁移，同时上调上皮细胞标志物E-cadherin以及下调间充质细胞标记物N-cadherin的表达从而逆转EMT过程，这表明FOXK1是一种前列腺癌转移潜能的潜在增强剂和EMT的诱导剂。此外，FOXK1通过上调β-catenin、c-myc、cyclin D1的表达蛋白水平，对Wnt/β-catenin信号通路起到正向调控作用，促进肿瘤的发生和转移[18]。

3.5 FOXK1基因与神经胶质瘤

与正常脑组织相比，胶质瘤组织和细胞系中FOXK1的表达增加，其过表达显著促进了细胞的增殖和周期转变，且FOXK1可通过激活神经胶质瘤细胞中的Wnt/β-catenin通路促进细胞生长[19]。同时，研究发现FOXK1在神经胶质瘤中的作用受到抑癌基因miR-137的靶向负调控。

然而另有研究表明，在胶质瘤组织和细胞中FOXK1的表达是下降的，且FOXK1的过度表达显著抑制胶质瘤细胞的增殖，迁移和侵袭。FOXK1可以与其下游分子MMP1、MMP9和VE-Cadherin的启动子结合，抑制转录。具有高FOXK1表达的神经胶质瘤比具有低表达的神经胶质瘤具有更长的存活时间[20]。ZRANB2是在大鼠肾小球旁细胞原代培养的差异性显示实验中发现的一种蛋白质[21]。ZRANB2的抑制降低了长链非编码RNA（lncRNA）SNHG20的稳定性和表达，而下调的SNHG20可通过SMD途径降低转录因子FOXK1 mRNA降解，从而增加FOXK1的表达。FOXK1下调血管生成拟态相关分子MMP1、MMP9、VE-钙粘蛋白的水平，并抑制神经胶质瘤细胞中的血管生成拟态形成[20]。

胶质母细胞瘤（GBM）是星形细胞肿瘤中恶性程度最高的胶质瘤，FOXK1在GBM组织和细胞系中过表达，其通过激活Snail的转录促进GBM细胞的EMT，从而促进GBM细胞的转移，同时还可以通过调控细胞周期促进GBM细胞的增殖[22]。

3.6 FOXK1基因与乳腺癌

在乳腺癌细胞系中FOXK1的表达下降，它在体内外均可抑制EMT和乳腺癌细胞的转移，且FOXK1表达越高，乳腺癌预后越好[23]。通过进一步的实验发现，FOXK1通过抑制转录因子Twist和血管内皮生长因子等关键致癌基因的转录，从而抑制乳腺癌EMT及血管生成，因此，在乳腺癌中FOXK1是一种潜在的肿瘤抑制因子。FOXK1还可以增强乳腺癌MRI表型的检测，并且与调节乳腺癌生长和转移的肿瘤抑制因子TET1在生理功能上存在相互关联。

3.7 FOXK1基因与食管癌

免疫组化实验表明，与正常食管黏膜组织相比，FOXK1在食管癌组织的表达显著增多。其表达水平与食管癌的分化程度相关，分化程度越低的肿瘤组织FOXK1的表达水平越低，且FOXK1的高表达是影响食管癌患者的预后及生存时间的作用因素，提示FOXK1可能成为食管癌患者的诊疗新靶点[24]。进一步的细胞实验发现，提高食管癌细胞内FOXK1的表达水平，可抑制细胞凋亡、促进细胞增殖和侵袭转移，而在食管癌细胞内抑制FOXK1的表达则得出相反的结果。

3.8 FOXK1与肝细胞性肝癌

FOXK1高表达于肝细胞性肝癌（HCC）组织细胞，敲除FOXK1基因可下调HCC细胞内β-catenin、cmyc和cyclin D1等蛋白的表达水平，相反，Wnt/βcatenin信号通路催化剂LiCl有效地逆转FOXK1敲除导致的HCC细胞增殖和侵袭效应。且有研究报道FOXK在胚胎中肠内胚层中介导TGF-β信号，因此TGF-β-FOXK1-Wnt信号可能在调控HCC细胞增殖和侵袭中发挥重要作用[25]。此外，Cui等[26]研究发现，FOXK1的下调可以抑制肝癌细胞糖酵解、降低肝癌细胞活力，这可能与其降低糖酵解关键酶HK2的表达有关。Akt/mTOR通路被证实可以通过刺激葡萄糖消耗和乳酸产生、激活HK2等途径从而增加细胞的葡萄糖摄取和糖酵解。Cui等[26]通过进一步的研究发现FOXK1的下调抑制了肝癌细胞中Akt/mTOR通路的激活，导致细胞糖酵解的抑制。

3.9 FOXK1基因与胃癌

FOXK1和原癌基因c-jun均表达于胃癌细胞核，c-jun可直接结合并激活人FOXK1基因启动子362-355 bp核心序列处；过表达FOXKl的MKN28稳定株沉默c-jun序列后，细胞的增殖、迁移和侵袭能力受抑制，FOXKl诱导的EMT也同样受到阻碍[27]。因此，FOXKl的启动子被c-jun识别激活后表达上调，发挥原癌基因作用促进胃癌进展。另有研究指出，miR-646为FOXK1在胃癌细胞中表达的调控基因，miR-646可通过下调FOXK1对抗TGF-β1诱导EMT亚型，抑制Bcl-2/Akt信号通路，从而抑制GC细胞增殖、转移和侵袭[13]。lncRNA LINC02163被证实参与胃癌的发生及发展，它在胃癌细胞系和组织中的表达增高。LINCO2163的抑制降低了FOXK1的表达，而当miR-593-3p被抑制时，LINC02163下调FOXK1表达的作用被消除。FOXK1过表达可抵消LINC02163下调对细胞生长、细胞周期分布和侵袭的影响[28]。因此，LINC02163可以通过miR-593-3p/FOXK1轴发挥其在胃癌中的癌基因作用。此外，在胃癌的发生发展中FOXK1与波形蛋白存在相互稳定和相互促进作用，其在胃癌细胞中的表达呈显著正相关。在胃癌细胞中FOXK1诱导EMT，促进胃癌的侵袭及转移，与胃癌的不良预后有关[28]。

3.10 FOXK1与结直肠癌

目前，关于FOXK1在结直肠癌的表达特点及其分子作用机制的研究最为广泛和深入。FOXK1在结直肠肿瘤著高表达，且其表达水平与患者的预后呈负相关，对其预后状态的单因素及多因素回归分析提示FOXK1在肿瘤组织中的表达为结直肠癌患者独立的预后因素[29]。有研究发现敲除FOXK1可诱导结直肠癌SW480细胞在G0/G1期阻滞[8]，由此提出FOXK1可能成为结直肠癌侵袭性的生物表型标志物和基因干预治疗的新靶标。而FOXK1和FHL2的共表达可诱导EMT促进结直肠癌细胞的增殖和转移，TGF-β1可上调LIM蛋白家族成员FHL2的表达，从而赋予癌细胞以转移的功能[30]，一系列的研究结果使FOXK1和FHL成为联合治疗结直肠癌特别是转移性结直肠癌的潜在靶点[31]。在体内结直肠癌中观察到，FOXK1的蛋白水平和细胞定位与RUFY3相似，RUFY3高表达可促进体内和体外结直肠癌细胞增殖，加强EMT和转移亚型，而siRNA介导抑制RUFY3可诱导G0/G1细胞周期阻滞，FOXK1被证实可通过原位移植促进RUFY3介导的转移FOXK1- RUFY3轴的形成促成且加快了结直肠癌的疾病进展[32]。除此之外，通过基因表达谱、蛋白印迹分析和相关性等分析发现，在结直肠癌细胞中，FOXK1的表达还与转录因子Snail呈正相关。进一步研究发现，Snail可与FOXK1启动子结合，反式激活FOXK1表达，从而促进结直肠癌肿瘤发生和EMT介导的侵袭转移。此外，荧光素酶报告基因测定显示FOXK1反式激活Cyr61启动子活性，它们的共同表达调控了结直肠癌细胞的迁移、侵袭和EMT[33-34]，因而靶向FOXK1-Cyr61-Snail轴可以为结直肠癌的治疗提供新的治疗方向。另外，荧光素酶报告基因测定发现miR-4492与结直肠癌结直肠癌细胞中的lncRNA LINC01503和FOXK1 mRNA存在相互作用，LINC01503通过抑制miR-4492在结直肠癌细胞中促进FOXK1的表达，而CCK8和Transwell测定表明FOXK1表达的恢复显著逆转了LINC01503敲低对结直肠癌细胞的抑制作用。

4 总结

综上所述，FOXK1参与EMT，介导TGF-β、Wnt/βcatenin和Bcl-2/Akt等多个信号通路，影响不同系统肿瘤细胞的增殖、转移和侵袭。FOXK1在肿瘤中作为一个新兴的原癌基因，对各个系统肿瘤细胞的发生、发展及预后起重要的作用。然而，与其他的肿瘤标志物相比，FOXK1的研究尚处于初步阶段，它的生物学功能及其影响各个系统肿瘤的具体机制还需进一步的深入研究。FOXK1有望成为不同系统肿瘤新的生物标记物及作用靶点，为患者的诊断、治疗及预后带来新的曙光。