EFNA3在结直肠癌中的表达及临床意义

段 洁，何艺伟，谢 明，杨 沙，陈贤永，周 君，曹慧秋

湘南学院12015级临床医学系，2基础医学院，3病理研究所，4附属医院病理科，湖南 郴州 423000；5郴州市第一人民医院中心医院病理科，湖南 郴州 423000

结直肠癌为世界上常见的消化道恶性肿瘤之一，我国结直肠癌的发病率与死亡率呈逐年升高的趋势[1-3]。结直肠癌容易发生肝脏转移和肿瘤化疗药物耐药，预后差[4]。在直肠及直肠与乙状结肠交界处发病率占60%的比例[5]。Eph家族蛋白包括促红细胞生成素产生肝细胞受体（Eph）[6]及其细胞表面的配体Ephrin。Ephrin A3（EFNA3）为Eph家族成员之一，是抑制血管再生基因[7]，Eph及Ephrin均属于膜蛋白，细胞间近距离的接触可以对其进行活化，同时还参与细胞的信号转导[8-9]。研究显示，EFNA3的表达差异与肿瘤的发生发展等存在密切关联。目前，国内已有关于EFNA3在不同肿瘤中表达情况的研究，且在不同肿瘤中EFNA3的表达情况也有所差异，然众多研究中并未见EFNA3在结直肠癌中的研究，因此本课题主要探讨EFNA3在结直肠癌中表达及意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集湘南学院附属医院2013～2017年手术切除的结直肠病例进行石蜡切片。其中结直肠癌组织44例，良性结直肠肿瘤组织20例，正常结直肠组织20例。对所选结直肠癌组织进行分组，按照TNM分期标准：Ⅰ～Ⅱ期18例，Ⅲ～Ⅳ期26例；按组织学分级：高分化17例，中低分化27例；按有无淋巴转移：26例有淋巴结转移，18例无淋巴结转移。结直肠癌组患者年龄35～99岁（63±14岁），良性结直肠肿瘤组患者年龄22～80岁（55±20岁），正常结直肠组患者年龄29～70岁（51±12岁）。

1.2 主要试剂

EFNA3抗体（Bioworld Technology），羊抗鼠/兔二抗试剂及其他免疫组化试剂（广州深达公司）。

1.3 实验方法

石蜡切片，烤片2 h，二甲苯脱蜡20 min，过无水乙醇洗去二甲苯，降浓度梯度酒精清洗，抗原修复，过氧化氢中孵育18 min，PBS洗3次（2 min/次），37 ℃一抗孵育（40 min），PBS洗3次（2 min/次），37 ℃二抗孵育（40 min），PBS洗3次（2 min/次），DAB染色（5～7 min），PBS洗3次（2 min/次），苏木精染色（6～8 min），冲洗，吹干，树脂封片。

1.4 半定量评分

采用半定量方法记录免疫组化结果，高倍镜下观察结直肠癌组中的癌巢细胞或正常结直肠组和良性结直肠肿瘤组中的腺上皮细胞，每例标本随机选取10个镜头。对于同一样本，评分从2个方面进行：（1）将染色强度分为4级，无染色记0，浅染色记1，棕色染色记2，棕褐色染色记3；（2）将阳性细胞百分率分为4级，阳性细胞百分率＜10%记为0，10%～25%记为1，26%～50%记为2，51%～100%记为3。对上述10个镜头下的评分结果取均值，以上评分结果均保留两位小数，将两个方面的评分累加得到该样本最终的半定量评分。

1.5 统计学方法

统计学分析利用SPSS 22.0进行，数据均采用均数±标准差表示。EFNA3组间对比采用单因素方差分析，组内对比采用两独立样本t检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 EFNA3表达于正常结直肠组织，良性结直肠肿瘤和结直肠癌中的情况

EFNA3的表达在结直肠癌，良性结直肠肿瘤与正常结直肠组织中均可检测到，阳性染色定位于胞浆（呈棕黄色）。EFNA3在结直肠癌组中表达强度低于良性结直肠肿瘤与正常结直肠组，差异有统计学意义（3.6±1.3vs5.1±0.6vs4.9±1.3，P＜0.05），正常结直肠组与良性结直肠肿瘤组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 结直肠癌中EFNA3的表达与临床病理特点的关系

EFNA3在结直肠癌组织中的表达强度，高分化组中显著高于中低分化组，差异具有统计学意义（P＜0.05，表1、图1）；按TNM分期Ⅰ～Ⅱ期显著高于Ⅲ～Ⅳ期，差异具有统计学意义（P＜0.05）；而在有淋巴转移组中表达强度显著低于无淋巴转移组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表1 EFNA3的表达与结直肠癌临床病理特点的关系

图1 EFNA3在正常结直肠组织（A）、良性结直肠肿瘤（B）和结直肠癌（C）中的表达（×400）

3 讨论

EFNA3是一类血管生成抑制因子，存在于胞膜表面。通过与特异性受体结合来介导细胞的信号转导，进而调节细胞的形态与功能[7-9]。有研究表明EFNA3为miR-210的一个直接作用靶点[10]，低氧条件下miR-210可通过下调EFNA3促进血管新生[11]。有研究在胰腺导管癌进行实验[15]，敲除EFNA3，结果证实EFNA3通过癌细胞的交叉网络促进肿瘤细胞的生长，其机制涉及细胞微环境的改变，特别是肿瘤组织新生血管的形成。有研究采用免疫组织化学的方法在卵巢癌中进行实验[16]，结果显示EFNA3在上皮性卵巢癌组织与正常卵巢组织中表达存在差异。根据近些年在乳腺癌当中的研究知，EFNA3在乳腺癌的发生发展中具有较为重要的作用，其主要机制是miR-210与靶基因EFNA3的调节。乳腺癌细胞分泌的外泌体组成中包含核酸miR-210，miR-210通过外泌体进入血管内皮细胞，作用于靶基因EFNA3，活化内皮细胞，诱导血管生成因子，从而促进血管的生成[12-14]。因此如果对EFNA3进行深入研究，有望进一步了解结直肠癌的发生、侵袭转移机制，也能为结直肠癌的治疗提供新的靶点。

本研究通过对84例结直肠组织进行免疫组化实验，统计结果后发现，EFNA3在结直肠癌组低表达，且在低分化，有淋巴结转移，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期中表达率降低尤为显著，即可认为EFNA3表达率越低，肿瘤恶性程度越高。且有研究证实，在多种恶性肿瘤如乳腺癌[15]、骨肉瘤[16]、前列腺癌[17-20]、神经胶质瘤[6]中EFNA3低表达，实验结果与我们的预期相符，EFNA3低表达于结直肠癌组织中。EFNA3随着癌症发生过程的逐渐深入而表达递减，因此我们认为EFNA3可能与结直肠癌的发生过程有关并在其中起到了类似抑癌基因的作用，这一现象可能与结直肠癌组织对EFNA3基因的抑制有关，但具体机制尚不清楚。总之，对EFNA3在结直肠癌中进一步研究，有望对结直肠癌的治疗开发一条新的思路。