肝癌血清特异标志物Dickkopf-1核酸适体的筛选及其鉴定

何 雷，赵运旺，李保林，安晓刚燕山大学环境与化学工程学院，河北 秦皇岛 066004；秦皇岛市第一医院，河北 秦皇岛 066000；空军军医大学西京医院，陕西 西安 700

目前，原发性肝癌的发病率位列世界第5，且发病率在世界范围内逐年上升[1]。近年来临床治疗手段有进步，但5年生存率极低，仅为3%～5%[2]。目前肝癌诊断主要依赖于影像学检查，而血清肿瘤标志物检测是唯一无创伤的检测手段，但敏感性较低，特别是在早期HCC的检测中仅为25%～65%[3-5]。因此，迫切需要寻找特异性更高、亲和力更强的肝癌血清标志物，从而为肝癌的早期诊断提供新的分子生物学检测手段。有研究发现了Dickkopf-1（DKK1），它是经典的Wnt信号通路分泌拮抗剂[6]。有研究在肝癌组织中发现DKK1表达水平是上调的，微阵列分析有预测早期或AFP阴性状态肝癌的价值[7]。

核酸适体是通过指数富集配基系统进化技术（SELEX）筛选获得[8-9]，即利用体外合成的随机寡核苷酸文库，经过多轮筛选，并结合PCR扩增技术，使其得到指数级富集，最终获得高亲和力、高特异性的核酸适体。核酸适体其自身能折叠成特定的空间结构与靶标分子特异性结合，常被称为“化学抗体”[10-12]。与蛋白抗体相比，核酸适体具有特异性更高、亲和力更强、稳定性好、免疫原性和毒性低、易于合成、化学修饰及穿透肿瘤组织等优点[13-15]。然而目前核酸适体在肿瘤学检测方面仍处于研究阶段[16]，目前研究未见报道DKK1核酸适体的筛选。本研究以DKK1为靶标蛋白分子，羧基化琼脂磁珠为筛选介质，采用SELEX技术筛选DKK1的核酸适体，建立一种简单、快速的基于核酸适体检测肿瘤血清标志物DKK1的分析方法，也为靶向药物治疗研制提供一定的思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

ssDNA文库（88 nt，1.2 nmol）：5′-CTATAGCAAT GGTACGGTACTTCC（40 N）CAAAAGTGCACGCTA CTTTGCTAA-3′（N=A、G、T、C）；引物P7：5′-CT ATAGCAATGGTACGGTACTTCC-3′；引物P11：5′-TTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3′；引物P11：5′-TTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3′及Biotin-P11引物（上海生物工程有限公司）。羧基化琼脂磁珠（普洛麦格生物技术有限公司）。DKK1抗原（2 mg/mL）、DKK2抗原（2 mg/mL）、DKK1-3抗原（2 mg/mL）（北京科卫有限公司）。1×PBS缓冲液（137 mmol NaCl，2.7 mmol KCl，6.5 mmol Na2HPO4，1.8 mmol NaH2PO4）。

1.2 消减SELEX技术筛选DKK1核酸适体

5 μg/mL DKK1与0.5 mL羧基化琼脂磁珠于1 mL PBS缓冲液，37 ℃孵育1 h。磁分离收集DKK1-磁珠复合物于1.5 mL EP管中，PBS缓冲液洗3次，加入1 mL封闭液（1% BSA，10 μmol/L tRNA，0.05% tween-20溶于PBS），37 ℃孵育30 min。PBS缓冲液洗3次，制备获得DKK1-磁珠复合物。按上述操作程序，分别制备获得DKK2-磁珠复合物、DKK3-磁珠复合物、DKK4-磁珠复合物。DKK2-磁珠复合物结合3 mL初级ssDNA文库（95 ℃，5 min；4 ℃，10 min；37 ℃，5 min），37 ℃孵育30 min。磁分离，未结合的ssDNA上清液与DKK3-磁珠复合物结合，37 ℃孵育30 min。磁分离，未结合的ssDNA上清液与DKK4-磁珠复合物结合，37 ℃孵育30 min。磁分离将未结合的ssDNA上清液加入到DKK1-磁珠复合物中，37 ℃孵育1 h。磁分离弃去未结合的ssDNA，PBS缓冲液洗3次，加入200 μL ddH2O，95 ℃加热10 min分离与DKK1-磁珠复合物特异结合的ssDNA。回收的ssDNA文库作为qPCR扩增的模板，链霉亲和素磁珠法制备获得次级ssDNA文库。重复上述筛选步骤。

1.3 链霉亲和素磁珠法制备次级ssDNA文库

整个筛选过程中，PCR的控制特别关键。在PCR扩增过程中引入有生物素修饰的引物，通过对称PCR扩增每一轮的次级ssDNA文库获得量较大的标记有生物素的dsDNA产物。dsDNA产物与300 μL链霉亲和素磁珠，37 ℃孵育30 min，磁分离获得biodsDNA-链霉亲和素磁珠复合物。PBS缓冲液40 ℃水浴4 min，洗去非特异结合的dsDNA。95 ℃热变性使双链DNA解旋实现其分离。再对其进行磁分离，收集上清液即获得次级ssDNA文库。

1.4 ELASA法实时监测筛选进程

按照链霉亲和素磁珠法制备次级ssDNA文库的方法，利用生物素标记的引物扩增获得标记有生物素的次级ssDNA文库。分别取50 μL磁珠于4个1.5 mL EP管中，分别标记为“1+”、“1-”；“2-”、“3-”EP管分别与200 μL DKK1、DKK2、DKK3、DKK4，37 ℃孵育1 h；投入每轮生物素标记后的ssDNA文库，37 ℃孵育30 min，1×Binding Buffer洗3次，然后加入1∶1000稀释的HRP-labeled Streptavidin 37 ℃ 孵育 30 min，1×PBS（含1.5% Tween-20）洗3次，200 μL TMB显色液，避光显色15 min，50 μL 1 mol/L H2SO4终止反应，置于酶标仪测定A450 nm值。

1.5 高通量测序及数据分析

将第6轮筛选获得的次级ssDNA文库作为模板，经对称PCR扩增获得dsDNA产物，扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，对其质量进行鉴定。将dsDNA送至上海生工生物工程有限公司进行高通量测序。预计每个文库测序得到约10 000条序列。

对高通量测序结果进行生物信息学分析。采用Clustal X软件和DNAman软件分析二代测序结果，拷贝数＞1 000的核酸适体的保守序列。采用mfold软件（Version 3.2）分析核酸适体的二级结构。

1.6 SPR测定DKK1核酸适体结合解离常数（Kd）

3个候选核酸适体与DKK1的解离常数（Kd）通过表面等离子共振体（SPR）测定。HEPES缓冲液作为运行缓冲液，50 μg/mL DKK1溶解于500 μL 10 mmol/L乙酸铵缓冲液（pH 6.0）中，稀释后的DKK1点在SPR芯片上于4 ℃过夜。将三个核酸适体稀释至一系列浓度。自动按照运行程序用于样品注射和再生的重复循环。监测核酸适体-DKK1复合物的结合和解离时间为300 s。通过使用动力学评估软件计算核酸适体与DKK1的相互作用。

1.7 圆二光谱分析DKK1核酸适体结构

为进一步确定核酸适体可能的二级结构特征。将终浓度为5 μmol/L的核酸适体（Apt-5、Apt-26、Apt-28）溶于10 mmol/L磷酸钠缓冲液（pH 7.0，含有0.1 mol/L KCl）中。将样品在90 ℃下加热变性5 min，然后逐渐冷却至室温。将变性后的核酸适体加到比色皿中，通过JASCOJ-810分光偏振计从320～220 nm收集CD光谱。

2 结果

2.1 每轮ssDNA文库的亲和力测试

采用消减SELEX技术循环筛选，利用生物素-链霉亲和素-辣根过氧化物酶系统检测1～6轮ssDNA文库与DKK1的亲和力。结果显示，亲和力在1～5轮明显上升，第5轮SELEX筛选以后达到饱和，因此在第6轮时终止筛选（图1）。

2.2 DKK1核酸适体的筛选

以DKK1为靶标，DKK2、DKK3、DKK4为反筛选靶标，通过6轮消减SELEX筛选获得饱和的次级ssDNA文库。每一轮筛选过程中用的ssDNA文库与DKK1的用量直接关系到筛选是否成功。为了获得高特异性的核酸适体，随着筛选轮数的增加，筛选的条件越来越苛刻，比如，投入的ssDNA文库逐轮减少，磁珠的用量逐渐减少，孵育时间逐渐缩短，洗脱力度逐渐增强。第1～6轮次级文库经对称PCR扩增后的dsDNA产物经3%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示第6轮扩增后的ssDNA次级文库的条带清晰，大小合适（88 bp），没有任何杂带（图2），与初始ssDNA文库片段大小吻合。

图2 1～6轮ssDNA PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测结果

2.3 高通量测序结果分析和二级结构预测结果

利用消减SELEX技术筛选核酸适体，通常对与靶标分子作用力达到饱和的核酸适体次级库进行高通量测序。第6轮SELEX筛选获得的次级ssDNA文库，利用一对无任何修饰的P7、P11引物经对称PCR扩增获得的dsDNA产物进行高通量测序，测序数据经去掉两端引物序列和两端adapter，得到10 000条序列，合成拷贝数＞1 000的核酸序列。最终经序列比对获得了3条与DKK1高特异性结合的核酸适体。获得的核酸适体文库中的3条高丰度核酸适体序列，占整个测序文库总量的54%。核酸适体测序结果（表1）。

表1 核酸适体测序结果

利用DNAman软件对3条核酸适体经多序列比对和同源性分析。测序结果与预期长度一致，得到的核酸适体中富含G、C碱基，其同源性达78.41%。同时，发现AGCG、AACCA和GGCGT序列均在这3条核酸适体中存在，提示，DKK1可能特异识别CCCCT、CGGTT和TGCGCG 3种保守DNA序列，而其余的序列则有一定的变化（图3）。

核酸适体是利用其形成特殊的、稳定的二级结构与靶标分子特异结合，因此我们对3条核酸适体的二级结构进行了预测。核酸适体结构主要以茎环结构、茎凸环结构等为主，而且序列中G≡C配对较多。其中茎可以起到稳定核酸适体空间结构的作用，而环与靶标结合。提示茎环结构可能是核酸适体与DKK1特异识别的结构基础。由此推断核酸适体与靶标的结合可能是结构依赖性的，而不是序列依赖性的。这与抗原-抗体的结合反应特别相似，但抗体是以初级结构识别抗原决定簇，而核酸适体碱基之间可能是通过疏水作用、碱基堆积力和氢键等作用力与靶标形成 “锁与钥匙”结构（图4）。

图3 核酸适体同源性分析结果

核酸适体的二级结构最低自由能代表了DNA空间结构的稳定性，其最低自由能越小，核酸适体所形成的二级结构越稳定。mfold软件计算的3个核酸适体的自由能最低能量值。

2.4 DKK1核酸适体Kd值

利用SPR仪测定候选核酸适体（Apt-5、Apt-26、Apt-28）与靶标DKK1的亲和力，将固定在SPR芯片上的DKK1分别与不同浓度的核酸适体（1～160 nmol/L）孵育测定其相互作用力。结果显示，筛选获得的3条核酸适体与DKK1的结合解离常数均在纳摩尔级水平。解离常数值Kd大小与亲和力高低成反比，Kd值越小，亲和力越大。核酸适体Apt-5、Apt-26、Apt-28的Kd值分别为12.26、24.85、21.18 nmol/L，Apt-5的Kd值最小，亲和力最高，Apt-26和Apt-28核酸适体亲和力相对较弱（图5）。

2.5 圆二色光谱的分析结果

利用圆二色光谱进一步研究了DKK1核酸适体分子的高级结构。如图所示，3个候选核酸适体（Apt-5、Apt-26、Apt-28）在265 nm附近显示正的特征肩峰谱带，在240 nm附近显示负的特征肩峰谱带，这一性质与G-四链体结构的特殊功能一致（图6）。

图4 核酸适体二级结构预测结果

3 讨论

SELEX技术是一种应用体外合成的大容量的随机ssDNA文库进行体外筛选、结合PCR扩增的技术[17-19]。文库中的寡核苷酸序列可以折叠形成发夹、假结、凸环和G-四分体等空间结构，与靶物质特异、稳定地结合，通过多轮筛选和PCR扩增富集，最终获得高亲和力、高特异性的ssDNA序列，称为核酸适体。核酸适体具有靶分子范围广、相对分子质量小、无免疫原性、易于人工合成、修饰和标记等优点，核酸适体在临床诊断、基础研究，甚至在疾病治疗领域中都显现其重要的应用价值。因此核酸适体能够成为最具前景的抗体替代品。有研究利用合成的DNA适体与荧光淬灭方法可以高通量地检测和区分体液中不同种类的蛋白质[20]。

本实验以DKK1为靶蛋白，以羧基化琼脂磁珠为筛选介质，从体外合成的随机ssDNA文库中筛选获得其特异核酸适体。利用消减SELEX技术，共进行6轮筛选DKK1核酸适体。通过链霉亲和素磁珠法制备获得次级ssDNA文库，有效地避免了不对称PCR制备过程中产生非特异ssDNA。整个筛选进程通过ELASA法实时监测[21]。筛选获得的次级核酸适体库通过高通量测序分离高丰度的一系列单一核酸适体序列[22]。该方法利用高通量测序从而有效地避免了利用传统方法克隆后测序，造成核酸适体的丢失和不完整。提高了核酸适体筛选的效率。同时，该实验利用其筛选获得的特异核酸适体建立一种基于ELISA的快速检测DKK1的方法，该实验耗时不足1 h，同时免去了ELISA封闭实验步骤和反复洗板的过程，成为本研究最大的亮点。此外，本研究采用羧基琼脂磁珠作为筛选介质，提高了靶蛋白与载体的偶联率，是目前SELEX筛选中良好的载体材料，使一轮的SELEX筛选时间缩短为2 h。

利用DNAman软件对其二级结构进行预测分析，结果显示核酸适体主要以茎环和茎凸环结构为主。序列中GC配对较多。其中茎可以起到稳定核酸适体空间结构的作用，而环与靶标结合。这提示，茎环结构可能是核酸适体与DKK1特异识别的结构基础。圆二色光谱分析结果显示，3个候选核酸适体（Apt-5、Apt-26、Apt-28）能特异形成G-四链体结构识别DKK1靶标蛋白。同时应用SPR仪的方法对筛选出的核酸适体的亲和力进行检测，结果显示核酸适体Apt-5 对DKK1有很好的特异性，该技术为检测血清中的DKK1提供了新的分子生物学方法。

图5 核酸适体亲和力测定结果

图6 圆二色光谱分析结果