莪术油对人乳腺癌细胞株MCF-7增殖以及细胞周期阻滞的影响

蒋钰为

(辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 118000)

乳腺癌现已成为女性最常见的恶性肿瘤，而我国乳腺癌发病率与发病速度均高于发达国家，严重威胁着女性的身体与身心健康[1]。目前，乳腺癌的标准治疗模式为手术、化疗、放疗、内分泌治疗、分子靶向治疗和中医药治疗等[2]。其中，中医药治疗乳腺癌以其效果显著、毒副作用小的特点被广泛用于临床和实验研究。莪术(Curcuma zedoaroa Ros.c)作为一味传统中药材，具有行气破血、消积止痛等功效[3]，临床常应用于癥瘕痞块、瘀血经闭、胸痹心痛、食积胀痛等病症的治疗。研究表明，其主要成分莪术油具有抗肿瘤、消炎、抗氧化、保肝等作用，对卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌、胃癌等均有疗效[4]。本研究采用LuminalB型乳腺癌细胞株MCF-7细胞作为研究对象，给予不同浓度的莪术油，观察其对MCF-7细胞的抑制作用以及对细胞周期的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

人乳腺癌细胞株MCF-7由中国上海细胞库提供；莪术油注射液购自哈尔滨三联药业有限公司(国药准字H20053467)；RPMI-1640(HyClone)；胎牛血清(四季青)；胰蛋白酶；PBS(1×)；二甲基亚砜(DMSO)；75%乙醇；超净工作台(Dl-CT-2N)；倒置显微镜(Olympus CKX31)；台式冷冻离心机(Allergra X-15R)；酶标测试仪(TECAN sunrise)；流式细胞仪(美国BD)；高温灭菌CO2培养箱(Thermo-371)。

1.2 MCF-7细胞培养

采用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养液培养MCF-7细胞于T25培养瓶中，放置于含5%CO2的37 ℃细胞培养箱中。细胞长至瓶底90%时，用胰酶消化成单个细胞，继续传代培养，取对数生长期细胞进行实验。

1.3 采用CCK-8检测不同浓度的莪术油对体外生长的MCF-7细胞的抑制作用

取处于对数生长期的MCF-7细胞，胰酶常规消化后成为细胞悬液，用含有胎牛血清的培养液稀释为约5×104/mL浓度，等量接种于96孔板，每孔100 μL。因实验需求同时接种3个96孔板。放入培养箱中培养24 h后，弃掉原培养液，加入浓度分别为100、150、250、300、400、500 μg/mL的莪术油，每孔100 mL，每组3个复孔，另设置无药物的对照组和完全培养基的空白组，放置于37 ℃培养箱中24、48、72 h后，弃掉原培养液，每孔加入100 μL浓度为10%CCK8(RPMI-1640稀释)，37 ℃孵育1 h。采用酶标测试仪在450 nm波长处检测各孔吸光值(OD值)，计算每组平均OD值，各药物浓度组对细胞的抑制率=(加药组平均OD值-空白组平均OD值)/(对照组平均OD值-空白组平均OD值)×100%。实验重复3次。

1.4 采用流式细胞仪检测莪术油对MCF-7细胞周期的影响

取处于对数生长周期的MCF-7细胞，胰酶常规消化成细胞悬液，用含有胎牛血清的培养液稀释至7.5×105/mL浓度，接种于6孔板，每孔2 mL细胞液。孵育24 h后加入浓度为200、300、400、500 μg/mL的莪术油，另设一组无药物对照组。37 ℃培养24 h后收集细胞，贴壁细胞用胰酶消化，离心1 000 r，5 min，弃去上清液。采用PBS冲洗后再次离心，弃上清，加入1 mL预冷的75%乙醇固定，放置于4 ℃冰箱。24 h后，离心4 ℃，3 000 r，10 min，弃掉上清后用预冷的PBS冲洗，离心弃上清，避光加入500 μL碘化丙啶溶液，放置培养箱30 min，每10 min摇晃一次。取出后离心弃上清，加入400 μL PBS冲洗后，用流式细胞仪对细胞进行检测。上述实验重复3次。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1莪术油对MCF-7细胞生长增殖的影响

实验结果表明，各浓度莪术油对MCF-7细胞均有不同程度的抑制作用，根据各组OD值计算得出抑制率，500 μg/mL组抑制率最高，且抑制率与药物浓度呈正相关。运用回归方程得出莪术油用于乳腺癌MCF-7细胞的半数抑制浓度(IC50)，加药后24 h、48 h、72 h的IC50分别为335.42 μg/mL、242.71 μg/mL和155.93 μg/mL(P<0.05)。见表1和图1。

组别 剂量(μg/mL)抑制率(%)24h48h72h空白组无细胞---培养基无药物---1007.7±2.4*28.6±3.9**36.6±3.2*15010.4±3.6**32.4±3.6*49.4±3.8**莪术油25030.3±3.2*42.0±2.3*61.0±3.0*30040.8±1.8*47.2±2.7*69.2±2.9*40050060.1±3.3*78.4±1.8*72.7±1.8*81.7±1.7*82.7±2.8*91.7±1.8*

注：与空白对照组相比，**P<0.05，*P<0.01。

图1不同时间作用下不同浓度莪术油对MCF-7细胞的抑制

2.2不同浓度莪术油对MCF-7细胞周期的影响

采用流式细胞仪对药物作用后的MCF-7细胞以及对照组进行检测，结果显示，不同浓度的莪术油作用细胞24 h后细胞周期均出现异常。药物作用24 h后，对照组细胞比率G1期为53.3%，S期为36.1%，G2期为10.6%(P<0.05)。与对照组相比，各药物组MCF-7细胞在G1期的比例均提高，浓度为200、300、400、500 μg/mL药物组G1期细胞比率分别为68.8%、73.1%、76.9%和81.3%(±)，而相应S期和G2期细胞数减少，由此说明莪术油是通过将细胞阻滞在G1期来实现抑制细胞增殖的目的。见图2。

图2 不同浓度莪术油对MCF-7细胞周期的影响

3 讨论

遗传、生育、过胖等内在因素到不良情绪、压力等外在因素都会导致乳腺癌的发生和发展。随着现代医学的不断进步，癌症患者的生存率有了明显提高，但复杂的医疗手段所带来的副作用与不良反应也不容小视。如今，中医药在治疗乳腺癌方面有了显著的进步，合理地运用其理念与疗法，不仅能改善患者全身症状，还能提高其生存质量[5]。现代药理学研究表明，莪术具有细胞毒性、诱导细胞凋亡、抑制正常细胞癌变等作用，具有抗肿瘤、抗血栓、抗病毒、抗纤维组织增生等活性[6]，所以在具有肿瘤抑制作用的中草药中，莪术有独特的优势。本研究将不同浓度的莪术油用于人乳腺癌细胞株MCF-7，结果显示，其对MCF-7细胞有明显的抑制作用，且随着作用时间的延长，对细胞的抑制率越来越高，细胞半数抑制浓度逐渐降低。流式细胞术显示，莪术油作用后MCF-7细胞G1期细胞比例增高，细胞周期在G1期被明显阻滞，说明莪术具有开发出抗癌药物的潜力。