夏枯草抗阿尔茨海默病的成分-靶点-通路的网络药理学研究

彭 壮，彭 莎，何超平，徐 佳，肖 岚，廖端芳，2*，李亚梅，2*

(1.湖南中医药大学 药学院 湘产大宗药材品质评价湖南省重点实验室，湖南 长沙 410208；2.湖湘中药资源保护与利用协同创新中心，湖南 长沙 410208)

夏枯草，为唇形科夏枯草属植物夏枯草PrunellavulgarisL.的干燥成熟果穗[1]，最初记载于《神农本草经》，其味苦、辛，其性寒，具有清肝泻火、明目、散结消肿之功，已知其含有的主要化学成分有多糖类、有机酸类、黄酮类、三萜及其苷类、甾体类、挥发油类等，已报道的药理作用主要有降糖、降压、抗菌、抗炎、抗肿瘤、免疫抑制、抗氧化以及抑制病毒生长，临床上主要用于目赤肿痛、目珠夜痛、头痛眩晕、瘰疬、瘿瘤、乳痈、乳腺癌、高血压、腮腺炎、浸润性肺结核等，作为一种药食同源的草本植物，至今已经有几千年的药用历史。

阿尔茨海默病(Alzheimer，s disease，AD)是一种以进行性认知功能减退，严重影响日常活动为主要特征的神经退行性疾病[2]。目前全世界有近4 680万AD患者，到2050年估计会达到1.3亿人[3]。AD作为一种社会疾病，给社会和患者家庭带来了沉重的负担，从2000年消耗在AD患者的医疗费用180亿美元增加到2010年的6 000多亿美元。据估计，到2050年费用将增加到1.2万亿美元[4]，已经成为影响全球的严重疾病并且受到全球所有相关研究人员的高度关注。AD的病理特征包括β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein，Aβ)的堆积，神经原纤维缠结和神经元的丢失[5]，有证据显示Aβ的堆积与载脂蛋白(apolipoprotein，ApoE)和炎症有着密切的关系[6-7]，它们共同参与AD的病程发展，也有研究表明使用抗炎药物可降低AD的发病率[8]，但目前并没有确切有效的抗炎药物在临床中报道出来。

目前有关夏枯草化学成分、药理机制及临床应用的研究不断涌现[9-10]，但未见整体系统地分析夏枯草中成分、靶点、通路和阿尔茨海默病的相互关系的报道。随着生物信息学、分子生物学、计算机技术的不断发展和联合应用，以及网络药理学[11]、整合药理学[12]等概念的逐步提出，这也为中医药科学的研究提供了新的思路与方法[13-14]，利用其整合生物信息学、分子生物学及各大数据库信息，系统地研究“药物-靶点-通路-疾病”之间的相互作用，探究中医药“多成分、多靶点、多途径”的药理机制，与中医药的整体观、辨证论治、组方配伍、协同增效等原则不谋而合[15]。本研究旨在利用网络药理学方法，探索夏枯草的主要物质基础、核心靶点及与阿尔茨海默病之间可能存在的相互关系，为后续进一步阐明夏枯草抗阿尔茨海默病的作用机制提供思路和理论基础。

1 材料与方法

1.1 数据库和软件

TCMSP数据库(http：∥lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)；

TCMID数据库(http：∥119.3.41.228/tcmid/search/)；

STITCH数据库(http：∥stitch.embl.de/)；

STRING数据库(https：∥string-db.org/)；

Cytoscape3.7.1软件；

Pubchem数据库(https：∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)；

TTD数据库(http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)；

DisGeNET数据库(http：∥www.disgenet.org/)；

UniProt数据库(https：∥www.uniprot.org/)；

Metascape数据库(http：∥metascape.org/gp/index.html#/main/step1)。

1.2 方法

1.2.1 夏枯草活性成分检索与筛选 通过在TCMSP数据库(中药系统药理学分析平台，http：∥lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)上检索夏枯草的化学成分，再根据药物的ADME(吸收、分布、代谢及排泄)相关特性，并且以多篇相关文献标准为参考，选择将夏枯草化学成分的口服利用度(OBioavail，OB)以及类药性(drug-likeness，DL)作为活性成分筛选的关键参数[16]，从而筛选出满足口服利用度OB>30%且类药性DL>0.18的化合物作为夏枯草潜在活性成分。同时，由于药物在机体内的吸收利用不只有口服一种途径，加之口服利用度低的能做成其他不同剂型，因此，应用TCMID数据库和文献检索，补充夏枯草中的其他有效成分。最后将筛选出的夏枯草潜在活性成分在Pubchem数据库中查询其结构式，并使用SMILES表达式。

1.孩子们大多已经入门，基本上能写出像模像样的对联来；共创作出对联一两百副，创作了不少好对子，得到亲友好评。

1.2.2 夏枯草活性成分靶点挖掘 使用TCMSP靶点查找夏枯草潜在活性成分的作用靶点，并在Uniprot数据库中将查找到的所有靶点蛋白名转换为相应的基因名。使用Cytoscape3.7.1软件对夏枯草的活性成分以及作用靶点进行相关网络构建。

1.2.3 疾病相关基因检索 使用TTD数据库和DisGeNET数据库中检索阿尔茨海默病(Alzheimer′s Diseases)的靶基因，将重复项去除，并查阅阿尔茨海默病靶基因的相关文献[17-20]，汇总阿尔茨海默病基因，并在UniProt数据库中进行基因和蛋白的转换。

1.2.4 蛋白互作网络构建 将“1.2.2”和“1.2.3”得到的蛋白一并导入STRING数据库，选择物种为“Homo sapiens”进行计算，最低相互作用阀值设为中等“medium confidence=0.4”，构建靶点群蛋白互作网络(protein protein interaction network，PPI network)[21]，即“夏枯草-靶点-阿尔茨海默病”网络。

1.2.5 关键靶点的筛选 使用Cytoscape对PPI网络进行拓扑属性分析，计算网络整体的“介数中心性(Betweenness Centrality)和节点度值分布(Node Degree Distribution)”，并将Degree、Closeness和Betweenness的均数作为“阈值”，选取3个参数同时都在阈值之上的靶点为“关键靶点”，研究筛选出关键靶点可能存在的药理作用。

Degree指网络节点和其他节点的连接数目；Betweenness为网络中出现所有最短路径中经过该节点的路径数目和最短路径总数的比值；Closeness为通过节点之间的传递距离对节点的重要度进行衡量。三者是衡量一个节点在网络中重要性的主要拓扑参数，也是判断一个靶蛋白是否为“关键靶点”的重要依据[22]。

1.2.6 关键靶点的代谢通路与生物过程分析 为了进一步研究夏枯草可以抗阿尔茨海默病的相关作用情况，拟使用Gather平台对夏枯草的抗阿尔茨海默病靶点群，进行GO生物过程富集分析，诠释夏枯草靶点的抗阿尔茨海默病生物过程，再进行KEGG代谢通路富集分析，研究夏枯草抗阿尔茨海默病的主要代谢通路。Gather数据库中的列表与背景均设置“Homo Sapiens”(人类)进行操作。

2 结果

2.1 夏枯草活性成分

在TCMSP数据库中查询得到夏枯草活性成分11个，在TCMID数据库和文献检索得到另8个活性成分，共19个活性成分(见表1)。

表1 夏枯草活性成分

2.2 夏枯草活性成分靶点

通过Cytoscape3.7.1软件得到夏枯草活性成分-作用靶点的网络图，19个椭圆形表示夏枯草的活性成分(M1～M19代表的化合物见表1)，253个不规则四边形为活性成分作用靶点，共有540条边代表靶点和化学成分之间的相互作用(见图1)，体现了夏枯草多成分、多靶点的特点。

图1 活性成分-靶点网络

2.3 阿尔茨海默病相关基因

在TTD数据库和DisGeNET数据库中检索阿尔茨海默病(Alzheimer′s Disease)的靶基因，共得到2 021个基因(其中TTD中检索到86个基因，DisGeNET中检索到1 981个，有46个重复)。

2.4 蛋白间相互作用网络构建

在TTD数据库和DisGeNET数据库中检索到阿尔茨海默病(Alzheimer′s Disease)的靶基因与夏枯草作用的靶基因有136个重复，这136个靶基因可能为夏枯草抗阿尔茨海默病的靶点。为研究各靶点在体内的相互作用关系，寻找核靶点，将潜在靶点蛋白群进行PPI网络分析(见图2)，结果共发现136个靶蛋白发生相互作用，产生2 440条代表蛋白之间相互作用的边。

图2 靶蛋白PPI网络

2.5 核心靶点的分析结果

通过Cytoscape计算得到，PPI网络平均度值为21，平均介数为1.44×10-2，平均紧密度为0.47，度值、介数和紧密度均超过平均值的靶蛋白共有39个，说明这39个靶点在PPI网络中处于关键位置，很可能是夏枯草抗阿尔茨海默病的关键靶点(见图3)。

此外，发现夏枯草的19种活性成分中的16种活性成分可能有抗阿尔茨海默病的作用，且其中M3(Quercetin)、M8(Kaempferol)、M12(Luteolin)、M13(wogonin)、M15(ursolic acid)、M19(Rosmarinic Acid)共6种活性成分可能为抗阿尔茨海默病的关键化合物。

注：最中间矩形为夏枯草，椭圆形为夏枯草活性化合物，菱形为夏枯草关键活性化合物，近菱形不规则四边形为关键靶点，最外侧不规则四边形为靶点。

图3 夏枯草(PV)有效成分靶标关联网络

2.6 Metascape分析KEGG和GO的结果

根据P值(校正)<0.01的标准，在Metascape数据库对39个关键靶点进行计算分析，最终得到关键靶点的相关通路信息。其中主要包括白介素信号通路、细胞对应激反应信号通路、PIP3激活AKT信号通路等，见图4和表2。

A.

表2 关键靶点的信号通路

4 讨论

本研究采用网络药理学对夏枯草的主要活性成分、作用靶点、相关生物信号通路及对阿尔茨海默病的作用等几方面的关联性进行了探讨。通过TCMSP 数据库共发现夏枯草的主要活性成分11 个，通过TCMID数据库和相关文献检索得到另外8个活性成分，一共得到19个主要活性成分，这19个成分分别是：Vulgaxanthin-I、Betulinic acid、Quercetin、Morin、Stigmasterol、poriferasterol monoglucoside_qt、Spinasterol、Kaempferol、Delphinidin、stigmast-7-enol、beta-sitosterol、Luteolin、wogonin、Oleanolic acid、ursolic acid、Hesperidin、Hyperoside、Rutin、Rosmarinic Acid，这可能是夏枯草发挥药效的主要活性物质，其中M3(Quercetin)、M8(Kaempferol)、M12(Luteolin)、M13(wogonin)、M15(ursolic acid)、M19(Rosmarinic Acid)共6种活性成分可能为抗阿尔茨海默病的关键化合物。检索阿尔茨海默病的相关靶点，与夏枯草活性成分作用靶点进行PPI网络构建，得到39个关键靶点。对关键靶点进行富集，得到夏枯草抗阿尔茨海默病的关键信号通路，主要包括炎症相关白介素信号通路、细胞对应激的反应信号通路、PIP3激活AKT信号通路，推测夏枯草的活性成分可能通过作用于相关的靶点蛋白从而影响相关的信号通路而发挥抗阿尔茨海默病的药效。从网络药理学角度探讨并揭示夏枯草的主要活性成分、作用靶点、相关生物信号通路和阿尔茨海默病的关系，为后续进一步研究夏枯草的作用机制提供理论依据，同时也为夏枯草的进一步临床研究开发及临床应用提供理论依据。

人类社会老龄化已成为人类发展的一种趋势，随着我国老龄化速度加快，老龄化人口急剧上升，且为世界老年人口最多的国家，阿尔茨海默病(Alzheimer Disease)的发病率也随着老龄化的进程而节节攀升。AD是一种中枢神经系统慢性退行性疾病，老年人是主要的发病人群，在65～74岁老年人中的发病率为3%，而在75～84岁的老年人中发病率上升至17%，更严重的是在85岁以上的老年人中发病率有32%[28]。目前在临床上针对阿尔茨海默病使用的药物有胆碱酯酶抑制剂类和谷氨酸受体阻断剂两类[29]，患者长期服用药物后虽痴呆症状得到减轻，但会产生睡眠障碍、肌肉痉挛、呕吐腹泻、心动过慢和加重哮喘等不良反应。因此，研究并开发有效的抗AD药物，具有非常重要的科学意义和社会价值。

关于AD的发病机制，有很多学者提出不同的假说，得到认可的主要有炎症机制、中枢胆碱能、tau蛋白的过度磷酸化、细胞凋亡机制、β-淀粉样蛋白、遗传因素以及肠道菌群失调等[29-30]。在AD患者的脑内，发现β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein，Aβ)特异性免疫反应机制受损，从而激活脑内的小胶质细胞，释放出炎症介质，引起局部的炎症反应，而局部的炎症反应又会加剧Aβ的堆积，进而形成恶性循环[31]。

通过网络药理学的Metascape分析，发现夏枯草活性成分可能发挥抗阿尔茨海默病的3个关键信号通路，这些相关通路都已经在相关研究中进行了报道，而针对夏枯草活性成分在目前并无抗阿尔茨海默病的报道，但已有研究表明，水蓼中的beta-sitosterol能充分到达大脑，抑制参与胆碱酯酶代谢的酶，并作为自由基清除剂而发挥抗AD的作用[32]，β-sitosterol能通过雌激素受体介导PI3K / GSK3β信号结合到膜而发挥抗氧化应激和脂质过氧化作用[33]。kaempferol能通过抗炎而发挥抗AD[34]，沉香中的kaempferol有抗AD的作用[35]，银杏中的kaempferol可以快速透过血脑屏障进入海马细胞外液，30 min内达到最大浓度，通过抑制脑内Aβ的形成从而发挥抗阿尔茨海默病效应[36-38]。Spinasterol已经被报道参与各种生物活动，可以通过细胞外信号调节激酶(ERK)途径来增加脑内细胞抗氧化的特性，具有抗氧化应激和神经炎症引起的神经退行性疾病的治疗潜力[39]，Stigmasterol已经被报道通过激活雌激素或NMDA受体来增强胆碱能神经传递系统从而发挥认知改善抗阿尔茨海默病的作用[40]。Delphinidin可以抗阿尔茨海默病主要是通过减弱细胞内钙的内流和tau蛋白过度磷酸化，保护细胞免受Aβ诱导的神经毒性[41]。Luteolin被报道为一种ROS清除剂，对AD的学习缺陷和海马结构具有潜在的保护作用[42]，Morin可以有效的破坏Aβ的聚集，细胞毒性小，可以改善阿尔茨海默病患者的认知能力[43]，Vulgaxanthin-I作为一种良好的过氧自由基清除剂，通过发挥抗氧化作用而对阿尔茨海默病发挥相应的药效[44]，丹参中的提取物stigmast-7-enol具有抗氧化抗炎及抗胆碱酯酶等活性，能对阿尔茨海默病起到一定的治疗作用[45]，同时黄酮类中的quercetin由于具有高氧自由基清除活性或者是抑制黄嘌呤氧化酶和脂质过氧化的能力，能可靠地增加神经元的抵抗力，抑制iNOS和调节COX-2的表达产生抗炎作用，从而发挥神经保护作用[46]。这些有效成分在夏枯草中均为夏枯草的主要有效成分，因而夏枯草可能通过抑制大脑胶质细胞活化所产生的炎症反应以及通过PI3K通路抗脑内的氧化应激对阿尔茨海默病起到治疗作用，这将为夏枯草抗阿尔茨海默病的作用及其机制研究均能有一定的启发作用，并为夏枯草抗阿尔茨海默病作用物质基础和作用机制研究提供一个思路。

本研究的结论依旧存在一定的局限性，由于本研究只依托数据库，通过数据的检索来对药物的功效进行预测，因此，还需要进行体内体外的实验研究来验证。同时，仅以OB和DL作为活性化合物筛选的指标有一定的局限性，因为药物的吸收利用不只口服这一条途径，还可做成其他剂型应用于临床，口服生物利用度低的成分需要得到重视，可能存在更广泛的治疗作用。本研究仅为中药科研提供一个思路，后续还需通过系统的实验研究进一步证实。