中药香囊抑菌性研究

陈瑞云，李 敏，彭 莺，李远文，徐 咏

(深圳技师学院，广东 深圳 518000)

香囊是中国传统艺术文化特色之物品，在其漫长的历史发展过程中，其外在形制、材料到内在蕴涵、象征、作用，都在演变。在香囊应用的历史进程中，人们慢慢发现，香囊因其内含物不同而具有不同的功用，可起前治病、辟秽之功用，并应用于中医外治法中。如：明代李时珍《本草纲目》记录了用辰砂装囊，戴身及髻中，治不寐。清代吴尚先的《理瀹骈文》亦收载了多个香佩方，如辟瘟囊、绛囊(内盛七宝如意丹)、抗痨丸佩囊等。中药香囊起防病治病的效果主要为其挥发性成分，现代研究表明，中药挥发性成分对呼吸道有和平滑肌有作用、有中枢神经作用、抗炎、抗过敏、抑菌杀菌、抗病毒等的药理作用[1]。在含挥发油成份的中药在功能归类中多为解表类、芳香化湿类指示香囊可能对空气菌落或治病菌有抑制或杀灭作用。同时，基于细菌的耐药性与抗生素滥用有明显相关，各卫生行政部门及各级医院对抗生素的合理使用进行严格监控，此外，众多学者致力于寻找其他新的有效的抗菌途径[2]。由此，本文依常用中药香囊配方如檀香、桂枝、白芷、苍术等药材制作香囊，研究其对静态空气中的菌落总数的影响及对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌等的抑制作用；同时，研究其香囊中挥发性成分对为以上致病菌的抑制作用，最终为中药香囊治未病和临床运用提供进一步的依据。

1 药材、仪器与试剂

药材：檀香(深圳和顺本草药业有限公司，20161107)；苍术(毫州大药业有限责任公司，20180508)、艾叶(毫州大药业有限责任公司，20180508)、白芷(毫州大药业有限责任公司，20180508)、桂枝(康美药业股份有限公司。170704361)、石菖蒲(陕西龙力药业有限公司，20160512)、檀香挥发油(吉安华新天然植物有限公司，20190925)、苍术挥发油( 吉安华新天然植物有限公司、20190925)、艾叶挥发油( 吉安华新天然植物有限公司、20190924)、肉桂挥发油(吉安华新天然植物有限公司、20190923)、白芷挥发油(吉安华新天然植物有限公司、20190921)、桂枝挥发油(吉安华新天然植物有限公司、20190925)、石菖蒲(吉安华新天然植物有限公司、20190925)。

试剂：(β)乙型溶血性链球菌(广东环凯微生物科技有限公司， CMCC(B)3221))；铜绿假单胞菌(广东环凯微生物科技有限公司，ATCC9027)；大肠埃希菌(广东环凯微生物科技有限公司，ATCC8739)；金黄色葡萄球菌(广东环凯微生物科技有限公司， ATCC6538)；白色念珠菌(广东环凯微生物科技有限公司，C0055B)；大豆酪蛋白琼脂培养基(TSA，广东环凯微生物科技有限公司，3106042)；沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA，广东环凯微生物科技有限公司，1064381)；pH值7.0无菌氯化钠溶液(广东环凯微生物科技有限公司，30105038)。

仪器：电子天平(昆山钰恒电子衡量器有限公司，LBA-5200)；分析天平(梅特勒-托利多(上海)有限公司，PB203-N)；立式压力蒸气灭菌锅(重庆雅马拓科技技有限公司，SQ810C)；三用恒温水槽(上海精宏仪器设备有限公司，DK-600); 超净工作台(广州市苏秦空调净化设备有限公司，型号SM-CJ-2FD)；生化培养箱(上海恒一科学仪器有限公司，DHP-9272)。

2 中药香囊的制备

取檀香、苍术、艾叶、白芷、桂枝、石菖蒲等中药材各等份，干燥后混合粉碎，称量20.00g装进棉布袋，封好。

3 中药香囊对空气菌落总数的影响

3.1 培养基配制

分别取TSA 、SDA各 40.00g，分别加入1000mL纯化水，加热煮沸溶解，取直径为9cm的平皿，加10mL培养基液平皿，121℃，100KPa，灭菌20min，得TSA、SDA两种培养基。

3.2 实验方法

选择94.5m3房间，将含TSB的培养皿放置在房间的四周和中央，关闭门门窗，将制好的TSA平板置于在离地84cm的空气中30min后取出，记录此时为0h。再于房间内四个角落各放入两个香囊，离地面高43cm，而后分别于1,2,4,6,8,12,48h放入平皿开盖暴露30min后，取出，盖好，置于37℃培养箱中，培养72h，平行三次，观察细菌生长情况并计数分析。

3.3 结果分析

比较香囊在静态空气放置时间对空气菌落的影响作用：计算公式：

每立方菌落数(cfu/m3)=5000N/A×T 。(A：平板面积(cm2);T：暴露时间(min);N：平均菌落数(cfu)。

香囊在静态空气放置时间长短对空气菌落总数影响见图1。

每立方菌落数以( X±S )cfu/m3表示，则0h、1h、2h、4h、6h、8h、12h、48h分别为12111±2416cfu/m3、9280±1604cfu/m3、7707±2354cfu/m3、6606±1541cfu/m3、5033±1900cfu/m3、4405±1901cfu/m3、4091±1821cfu/m3。依统计软件SPSS 17.0进行分析，组间比较采用t检验，空气中细菌从1小时后平均数均显著小于0h的每立方空气细菌平均数(且P<0.05) ，表明中药香囊对空气细菌有抑制或杀灭作用。依数据作图，可知随香囊放置时间的增加菌落总数递减，同时，由数据处理较看出随着香囊放置的时间越长，细菌平均数越来越少，直到12h后，达到平衡。由此说明香囊在空间放置时间与细菌抑制作用成正相关，而这个正相关并不一直延伸，抑制作用有最终有一个平衡值。

(横坐标：放置时间(h)；纵坐标：菌落总数据)

4 中药香囊对致病菌的抑制作用

4.1 菌株菌液配制

将金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、乙型溶血链球菌用TSB斜面进行复苏，取对数生长期的各菌液接种于TSA斜面进行保存，在37℃培养24h，以pH值7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液洗下菌苔，经梯度稀释后，采用平皿计数法计数，菌液浓度调制<300cfu/mL。白色念珠菌以SDB培养基复苏，对数生长期的的各菌液接于SDA斜面，同法制成白色念珠菌液。

4.2 香囊预处理

取“2项下”的香囊，于260nm紫外杀菌灯照射1h，备用。

4.3 实验菌液配制

取“4.1项下”各菌液1mL在加入不同带15mL的培养基的平皿中，制得阳性对照和供试样，取16mL SDA和TSA培养基，分别作为阴性1、阴性2。阳性对照和供试样各18份，阴性1和阴性2各20分。

4.4 实验过程

用新洁尔灭(1:14)对0.50m3的超净台进行消毒，并开启层流净化装置和紫外灯照射30min后，放入两个阴性样空白，30min后取出，然后放入香囊、阳性样、供试样、阴1、阴2。分别于0,30,60,120,180,240,300min，取出阳性样、供试样、阴1、阴2各3份。

完成以上实验后，将各样品于32.5℃下培养3天；含SDA培养基的样品于25.5℃下培养5天。

4.5 结果

依统计软件SPSS 17.0进行分析，阳性组与供试组各组时间相比较采用t检验，得P<0.05，组间差异有统计学意义。说明香囊中挥发性成份对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、伤寒沙门氏菌、乙型溶血性链球菌有抑制作用。

依图2、表1可看出，香囊挥发性成分与致病菌接触到一定时间菌落总数下降明显，因此用统计软件SPSS 17.0对供试组中各接触时间较采用t检验进行两两比较，得：肠供试30min与120min及其后三组时间对比t检验P<0.05，金供试30min与180min及其后两组时间对比t检验P<0.05，铜供试30min与300min对比t检验P<0.05，乙供试30min与300min对比t检验P<0.05，说明香囊的挥发性成份与大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、乙型溶血性链球菌接触时间长短会影响抑菌效果；白供试不同接触时间之间t检验P>0.05，随着接触时间的延长抑菌效果没有显著差异。

表1 香囊对致病菌的抑制作用结果

图2 香囊挥发性成分对致病菌的影响

检验结果所有供试组与阳性两组组间差异P<0.05。大肠杆菌供试30min与120min及其后三组t检验P<0.05；金黄色葡萄球菌供试30min与180min及其后两组时间对比t检验P<0.05，铜绿假单胞菌供试30min与300min对比t检验P<0.05，乙型溶血性链球菌供试30min与300min对比t检验P<0.05；白色念珠菌供试不同接触时间之间t检验P>0.05。

5 中药香囊挥发性成分抑菌性研究

5.1 菌株菌液配制

菌液一：将金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、乙型溶血链球菌用TSB进行复苏，取对数生长期的各菌液接种于TSA进行保存，在37℃培养24h，以pH值7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液洗下菌苔，经梯度稀释后，采用平皿计数法计数，菌液浓度调制< 10000cfu/mL。

菌液二：将白色念珠菌(白)用SDB培养基进行复苏，取对数生长期的各菌液接种于SDA斜面进行保存，在37℃培养24h，以pH值7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液洗下菌苔，经梯度稀释后，采用平皿计数法计数，菌液浓度调制< 10000cfu/mL。

5.2 实验过程

5.2.1 准备供试品

模拟香囊和香囊棉球香味挥发特点，利用滤纸法，研究香囊中中药的挥发性成分对致病菌的抑制效果。

5.2.1.1 混合挥发油供试品

将檀香、桂枝、石菖蒲、苍术、白芷、艾叶挥发油各100μL经无菌滤过后，加入棕色试剂瓶，混匀，将灭菌过的直径为6mm滤纸片试剂瓶，待滤纸润湿后，取出，自然挥干，备用。

5.2.1.2 单方挥发油供试品

取檀香、石菖蒲、桂枝、白芷、苍术、艾叶挥发油各600μl经无菌滤过后，分别加入不同棕色试剂瓶，将灭菌过的直径为6mm滤纸片分别装入含不同挥发油的棕色试剂瓶，待滤纸润湿后，取出，自然挥发5min后，备用。

5.2.2 菌液培养基配制

金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门菌、铜绿假单胞菌、乙型溶血链球菌选TSA，白色念珠菌选SDA，取培养基20mL加入平皿，待培养基凝固后，加入对应的菌液5mL，摇匀，各菌分供试平皿和阳性平皿；同法制作不含菌液的阴性平皿(平行三份)。

5.2.3 抑菌圈试验

混合挥发油，檀香挥发油、石菖蒲、苍术挥发油、白芷挥发油、艾叶挥发油采用十字交叉法制做供试品。经前期试验，桂枝样品抑菌作用较强，需单独用四个平皿做。用灭菌未沾挥发油的滤纸，同法制作阴性样品(平行三份)。

5.3 结果与分析

结果显示(见表2)，依实验方法下的制得含各种挥发油的滤纸片，对金黄色葡萄球菌和乙型溶血性链球菌有抑制作用，其中除檀香挥发油外，混合挥发油、石菖蒲挥发油、白芷挥发挥发油、桂枝挥发油、艾叶挥发油、苍术挥发油对大肠埃菌、乙型溶血性链球菌、白色念珠菌有抑制作用。依表4挥发抑菌圈大小排序得，桂枝挥发油制得滤纸片抑对五种致病菌抑制作用最强，混合油第二，石菖蒲挥发油第三，苍术挥发油、白芷挥发油、艾叶挥发油对五种致病菌抑制作用相当，檀香在实验方法下对大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、乙型溶血性链球菌没有抑制作用。

表2 香囊挥发性成分对致病菌的抑制作用

表3 挥发油抑圈大小排序

6 讨论

6.1 依实验所得实验条件下，中药香囊对空气细菌有抑制或杀灭作用。同时，由数据看出随着香囊放置的时间越长，细菌平均数越来越少，直到12h后，达到平衡。由此说明香囊在空间放置时间与细菌抑制作用成正相关，而这个正相关并不一直延伸，抑制作用有最终有一个平衡值。

在对致病菌抑制方面，相对于没有与香囊挥发性成分接触的阳性样品，组间差异有统计学意义。说明香囊中挥发性成份对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、伤寒沙门氏菌、乙型溶血性链球菌有抑制作用。同时，香囊挥发性成分与大肠接触到一定时间菌落总数下降明显，经统计，说明香囊的挥发性成份与大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、乙型溶血性链球菌接触时间长短会影响抑菌效果，而香囊与白色念珠菌接触30min基本达到平衡。

由此说明，香囊在防病治病方面，其中一个机理是对致病菌的抑制作用。同时，由于香囊与大部分实验菌的接触时间成正比关系，为临床应用提供依据。

6.2 在现代文献研究方面，香囊中各组分单方挥发油的抑菌性研究如下：檀香挥发油对幽门螺旋杆菌，白色念珠球菌、金黄色酿脓葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、克雷白氏杆菌，枯草芽胞杆菌、伤寒沙门氏杆菌、分支杆菌、腋菌、犬小孢子菌、须毛癣菌、红色发癣菌、黑曲霉和烟曲霉等细菌和真菌有不同程度的抑制作用；桂枝挥发油能抑制多种细菌的生长，如大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒病菌、炭疽杆菌、肺炎球菌、霍乱弧菌、志贺痢疾杆菌等致病菌[17-18]；石菖蒲挥发油，对表皮葡萄球菌、A 群链球菌、福氏志贺菌抑菌，白色念珠菌及金黄色葡萄球菌有抑制作用，而对大肠埃希菌抑制作用的有无，不同文献有一定的争议[27-28]。苍术挥发油对黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌、青霉、黑曲霉、黄曲霉、幽门螺旋杆菌有抑制作用，对沙门氏菌没有抑制作用[43-44]；艾叶挥发油对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、铜绿假单孢菌、土生克雷伯菌、肺炎克雷伯菌、炭疽杆菌、绿脓杆菌有抑制作用，而对巴氏杆菌、链球菌、沙门氏菌的抑菌效果不明显[40-42]；文献指出白芷脂溶性成分香豆素类成分对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、根霉、黑曲霉、酿酒酵母的抑菌效果明显[30]，但现代文献对白芷挥发性成分的抑菌性研究较少。

在本实验条件下，发现除文献所述的各挥发油抑菌作用外，檀香挥发油对金黄色葡萄球菌有抑制作用；桂枝对铜绿假单胞菌、乙型溶血性链球菌、白色念珠菌抑制作用；石菖蒲对大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、乙型溶血性链球菌有抑制作用；白芷对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、乙型溶血性链球菌、白色念珠菌有抑制作用；苍术对铜绿假单胞菌、白色念珠菌、乙型溶血性链球菌有抑制作用；艾叶挥发油对白乙型溶血性链球菌有一定抑制作用，填补了体外抑菌实验的空白。

6.3 对香囊中各组分的现代药理学研究中，各组分除了具有抑菌作用外，还具有其他功能如：檀香挥发性成份，可以抑制新斯的明导致的肠亢进[3]，可以快速缓解突发性心绞痛的症状[4]；具有抗炎抗氧化抗肿瘤作用[5-7]，还具有降血糖、抗高血脂方面药理作[8-9]。同时已经得到多方面证实抗病毒方面药理作用，现檀香挥发油已广泛应用于疣、瘢[10-16]。桂枝的挥发性成分有解热镇痛、抗炎抗过敏作用[18-20]。石菖蒲挥发性成分可以增加血脑屏障的通透性，能兴奋中枢神经作用；能保护心脏，降低血栓发生几率；还具有抑制呼吸系统过敏作用、缓解支气管平滑肌痉挛作用[21-26]。苍术早于1979年,Endo K等[31]已报道关其挥发油成分具有抗炎，因此对苍术挥发油研究多在抗炎方面，现已明确其机制与抑制组织 PGE2生成有关[32]，苍术挥发性还具有保肝、利尿作用和对中神经系统有镇静作用[33-34]。还有文献研究表明，苍术挥发性成β-桉叶醇[35]抗缺氧能力。艾叶挥发性成分具有抗炎，抗过敏和镇痛作用，抗肝纤维化作用， 抗疲劳作用，增加免疫力作用[36-39]。白芷挥发性成分具有抑制黑色素、抗氧化、镇痛、抗过敏、抗惊厥、抗痉挛等药理作用[29]。由此可见，中药香囊除了对外界菌落有影响外，还能调节人本机，以达到防病治病的效果。