不同产地菊花黄酮化合物抗氧化活性研究

雷康藤，韩笑笑，龙娟娟，杨琳妹，张毛毛，钮谷雨，张 培

(滁州学院 材料与化学工程学院，安徽 滁州 239000)

菊花为菊科植物菊(Chrysanthemum morifolium Ramat.)的干燥头状花序，具有清热解毒、平肝明目的作用，可用于治疗风热受寒、头痛目炫、眼目昏花等病症[1]。依据其产地和处理方式的不同，菊花具有滁菊、贡菊、亳菊、杭菊、怀菊等多种类型[2-4]。菊花的主要作用成分是黄酮化合物，根据药理学实验，黄酮化合物具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗炎等多种生物活性[5-7]。目前，关于菊花抗氧化活性的研究较多，但关于不同产地菊花黄酮化合物抗氧化活性比较的文章较少，故难以发现其中的规律与黄酮化合物产生功效的作用机制。

为了全面、系统地评价不同产地菊花的质量与其抗氧化活性之间的关系，本实验从4个不同产地的菊花(亳州、滁州、黄山和杭州)中提取其主要活性成分--黄酮化合物，并对其抗氧化活性(清除羟基自由基能力、清除超氧阴离子自由基能力及还原能力)进行研究，以期为菊花在保健品和食品方面的研究与开发提供基础资料。

1 试剂和仪器

抗坏血酸(阿拉丁试剂)、邻菲罗啉(天津市光复精细化工研究所)、无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)、Tris(国药集团化学试剂有限公司)、芦丁(中国食品药品检定研究)，实验所用滁菊、亳菊、杭白菊、贡菊均购于滁州华巨百姓缘大药房。

Cary 100 Scan 紫外可见分光光度计(美国Varian公司)、分析天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)、烘箱(上海三发科学仪器有限公司)、旋转蒸发仪(郑州凯祥仪器设备有限公司)。

2 结果与讨论

2.1 黄酮化合物的提取

称取四种不同产地的菊花各10 g，加入60%乙醇，于60 ℃回流提取2次，每次2 h。合并滤液，减压蒸馏至一定体积，加入适量水使其呈现混悬的状态，分别用石油醚、氯仿萃取，得氯仿萃取液，减压蒸馏，得浓缩液，50 ℃干燥后，即得黄酮类化合物，称重，计算产率。四种产地菊花(滁菊、亳菊、杭白菊、贡菊)中黄酮的产率依次为：31.2%、34.5%、27.8%和30.9%。由此可知，亳菊的黄酮的提取率最高，杭白菊最低。

2.2 总黄酮含量的测定

采用亚硝酸钠-硝酸铝法测定四种不同产地菊花黄酮化合物总黄酮含量。

(1)标准曲线的制备

精密称取芦丁10.0 mg至 50 mL容量瓶内，用60%乙醇溶解并定容，摇匀，得芦丁对照品溶液。分别精密移取0.00，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00 mL芦丁对照品溶液至7个25 mL容量瓶中，加入5% NaNO2溶液1 mL，静置5 min后，加入10% Al(NO3)3溶液1 mL，放置6 min，分别加入12% NaOH溶液10 mL，60%乙醇定容，摇匀，反应15 min后，于521 nm处测定吸光度。以芦丁对照品浓度(X:mg/mL)为横坐标，吸光度(Y)为纵坐标，建立标准曲线回归方程为：Y=7.2795X - 0.0008(X: mg/mL，R=0.9988)，溶液在0～0.048 mg/mL范围内线性良好。

(2)样品溶液的测定

分别称取不同产地的菊花黄酮化合物0.8 g左右于10 mL容量瓶中，用60%乙醇溶解并定容，得样品溶液。移取样品溶液1 mL于25 mL容量瓶中，按"标准曲线的制备"操作，处理各样品，测吸光度。将各样品吸光度带入芦丁标准溶液线性回归方程中，计算总黄酮含量。四种产地菊花(滁菊、亳菊、杭白菊、贡菊)中黄酮化合物总含量依次为：14.51%、11.84%、12.45%和13.66%。由此可知，滁菊黄酮化合物总黄酮含量最高，亳菊最低。

2.3 黄酮清除羟自由基的测定

分别移取2.00 mL pH值7.4的磷酸盐缓冲液和2.5 mmol/L邻二氮菲溶液3.00 mL于10 mL容量瓶中，混匀，加入0.50 mL 15 mmo1/L FeSO4溶液，迅速摇匀；然后再分别加入1.00 mL不同浓度各产地菊花黄酮化合物样品溶液和1.00 mL 0.1%的H2O2溶液，用去离子水定容到10 mL；未损伤管不需要加样品溶液和H2O2；损伤管不加样品溶液；以抗坏血酸作为阳性对照。在37 ℃条件下反应1 h后取出，于510 nm处测吸光度。记录数据，并按以下公式计算黄酮清除羟自由基能力。

·OH清除率(%)=(A2-A1)/(A0-A1)×100%

式中:A0——未损伤管的吸光度；

A1——损伤管的吸光度；

A2——样品溶液的吸光度。

实验结果如图1所示，不同产地菊花黄酮化合物及抗坏血酸的羟基自由基清除率均随着浓度的增大而增大，且抗坏血酸的清除率明显高于各产地的菊花提取物。 当浓度为0.32 mg/mL时，贡菊清除能力相对较高，为65.58%。亳菊、杭白菊、滁菊的清除能力略低，依次为47.07%、42.25%、41.12%。

图1 四种产地不同浓度菊花黄酮化合物及抗坏血酸对氢氧自由基的去除率

2.4 黄酮清除超氧自由基的测定

分别用移液管移取4.50 mL Tris-HCl缓冲溶液于10 mL的试管中，恒温预热20 min(20 ℃水浴)后，分别加入从各产地系列浓度的菊花黄酮化合物样品溶液1.00 mL以及0.4 mL的25 mmol/L邻苯三酚溶液，均匀混合；在25 ℃恒温水浴5 min之后，加入1.00 mL 8 mol/L HCl溶液，使反应停止，于299 nm处测吸光度。其中，空白对照不加样品液，阳性对照选用抗坏血酸。平行实验三次。依照下式计算黄酮清除超氧自由基的能力。

式中:A0——未加样品时邻苯三酚吸光度；

A1——加样品后邻苯三酚吸光度。

实验结果如图2所示，不同产地的菊花黄酮化合物均具有一定的清除超氧阴离子自由基的能力，且随着黄酮化合物浓度的增大而升高。当浓度为0.32mg/mL时，杭白菊清除能力最强，为54.09%，滁菊最弱，为32.36%。

图2 四种产地不同浓度菊花黄酮化合物对超氧阴离子自由基的清除率

2.5 黄酮还原能力的测定

分别移取2.50 mL各产地系列浓度的菊花黄酮化合物样品溶液到10 mL容量瓶中，分别加入2.50 mL pH值= 6.6的磷酸缓冲液和2.50 mL 1%的铁氰化钾溶液，均匀混合后，40 ℃保温15 min，加入2.50 mL 10%三氯乙酸溶液，3000 rpm离心10 min；取上清液5.00 mL，再分别加入去离子水5.00 mL和0.1% FeCl3溶液1.00 mL，于700 nm处测定吸光度，记录数据。其中，空白对照不加样品液，阳性对照选用抗坏血酸。平行实验三次。

实验结果如图3所示，滁菊、亳菊、杭白菊和贡菊都具有一定的还原能力，且与菊花黄酮化合物的浓度成正比，但均低于抗坏血酸阳性对照组。四种菊花中，亳菊的还原能力最强，贡菊的还原能力最弱。

图3 四种产地不同浓度菊花黄酮化合物的还原能力

3 总结

本实验首先从四种不同产地的菊花中提取黄酮化合物，测定总黄酮含量，并从三个方面(清除羟基自由基、超氧阴离子自由基能力及还原能力)研究四种不同产地菊花中黄酮化合物的抗氧化活性，结果表明，四种菊花中，亳菊黄酮化合物含量最低，滁菊最高。不同产地的菊花黄酮化合物均具有一定的抗氧化活性。