自噬增强拮抗褪黑素诱导的胃癌细胞增殖抑制作用

朱辉 ，江婷婷 ，黄晓琪 ，王丁杰 ，郭晓兰 ，周瑞祥 ，刘卉 *

（福建医科大学 1基础医学院干细胞工程与再生医学省高等学校重点实验室，2临床医学部，3基础医学院人体解剖与组织胚胎学系，福州 350122)

根据2018全球癌症统计报告，中国的胃癌发病率和死亡率分别居癌症发病和死亡的第3位和第2位[1]。由于约70%胃癌确诊时已为中晚期，化疗是主要治疗方法[2]，但由于化疗药物不良反应明显及多药耐药的存在使得胃癌化疗预后不佳。褪黑素(melatonin, MLT)是一种主要由松果体分泌的神经内分泌激素，大量研究表明，褪黑素对于神经胶质瘤[3]、甲状腺癌[4]、乳腺癌[5]、胃癌[6]等多种肿瘤皆有明显的抑制作用。细胞自噬是广泛存在于真核细胞中的一种生命现象，细胞自噬在胃癌细胞的生长、侵袭和抗肿瘤药物的疗效上扮演着双重角色[7]。一方面细胞自噬可降解功能失调的蛋白和细胞器，防止细胞不必要产物的毒性积聚，具有抑制肿瘤发生发展的作用[8]；另一方面，自噬保护一些肿瘤细胞免受营养剥夺和低氧条件的伤害，这是肿瘤细胞抵御严酷的肿瘤微环境和其他抗癌治疗的手段之一[9,10]。细胞自噬在褪黑素抑制胃癌细胞增殖过程中的作用仍不明确。本研究建立褪黑素体内外干预胃癌细胞的模型，应用透射电镜观察法、CCK-8法和Western blot法等对肿瘤细胞自噬相关指标进行检测分析，探讨细胞自噬在褪黑素抗胃癌过程中的作用，为进一步完善褪黑素抗胃癌细胞增殖机制提供基础依据。

材料与方法

1 荷癌动物模型建立及分组

SPF级雄性615近交系小鼠24只，体重（20±2）g，6～8周龄，购自中国科学院天津血液病研究所[生产许可证号：SCXK（津）2015- 0001]，适应性饲养一周后开始实验。24只小鼠随机分为生理盐水溶媒组，25mg/kg褪黑素组，50mg/kg褪黑素组各8只。小鼠前胃癌细胞株（murine foregastric carcinoma,MFC）细胞计数后，按7.5×105个细胞/小鼠，右腋皮下注射，接种后小鼠每日正常饮水、进食，一周后小鼠右腋下可触及明显肿块，说明荷瘤模型建立成功。生理盐水溶媒组：荷瘤成功后（接种第6天起）每天腹腔注射生理盐水100mg/kg，含0.1%无水乙醇；25mg/kg褪黑素组：荷瘤成功后（接种第6天起）每天腹腔注射MLT 25mg/kg；50mg/kg褪黑素组：荷瘤成功后（接种第6天起）每天腹腔注射MLT 50mg/kg。褪黑素临用前以无水乙醇溶解，再加生理盐水配制，使乙醇浓度为0.1%，置4℃遮光保存备用。褪黑素每天腹腔注射时间为17:00，注射7d后取肿瘤组织。

2 肿瘤组织取材测量及HE染色

首先引颈处死小鼠，酒精消毒后剪开右腋皮肤,完整剥离肿瘤组织并测量肿瘤长径和短径，按公式计算肿瘤体积：体积（mm3）=短径2×长径/2。将剥离的肿瘤组织切成大小约0.5cm×0.5cm×0.5cm的组织块，4%多聚甲醛固定。酒精梯度脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋。将包埋好的蜡块切成5μm厚的薄片，常规HE法染色：脱蜡复水，PBS冲洗后，苏木精浸染3min，自来水冲洗1min，0.5%盐酸乙醇分化3s，0.2%氨水返蓝30s，蒸馏水水洗1min，1%伊红浸染约20s，自来水冲洗1min，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

3 细胞培养及分组

小鼠前胃癌细胞（MFC）购自中国科学院上海生命科学研究院，培养基为RPMI-1640，含10%胎牛血清。用0.25%胰蛋白酶消化30s，每隔3d（90%细胞融合时）传代，在37℃、5%CO2的培养箱内培养。取对数生长期的MFC细胞，培养24h待细胞贴壁后进行药物干预并分为4组：空白对照组（不加任何药物干预，只加等量的培养液）；褪黑素组（加入1mmol/L MLT)；自噬抑制剂3-MA组[8mmol/L 3-MA（上海源叶生物科技有限公司）]；联合给药组（8mmol/L 3-MA 预处理细胞1h后加入1mmol/L MLT）。

4 CCK-8法检测MFC细胞增殖活性

取对数生长期的MFC细胞，以5000个/孔接种于96 孔板，培养24h待细胞贴壁后进行不同分组药物干预。每组设6个复孔，给药24h后每孔加入10μl CCK-8溶液（日本同仁化学研究所），37℃孵育1h，450nm 测定吸光度。按下列公式计算：肿瘤细胞增殖率=（各加药孔吸光度均值-空白孔吸光度均值）/（对照组吸光度均值-空白孔吸光度均值）×100%。

5 自噬的透射电镜术经检测

荷癌动物肿瘤组织：将肿瘤组织切成0.5mm3大小的小块，加入足量的电镜固定液（3%戊二醛和1.5%多聚甲醛的混合液，pH7.2）固定24h，送福建医科大学电镜室进行透射电镜包埋、超薄切片和检测。

MFC细胞：用0.25%的胰蛋白酶消化对数生长期的MFC细胞，以1.0×106个接种于10cm细胞培养皿中，培养24h待细胞贴壁后进行分组药物干预。给药24h后收集对照组和MLT组的细胞，1000r/min离心5min，吸净培养液后加入足量的电镜固定液（3%戊二醛和1.5%多聚甲醛的混合液，固定4h），送福建医科大学电镜室进行透射电镜包埋、超薄切片和检测。

6 Western blot 法检测beclin-1和LC3-Ⅱ水平

荷癌动物肿瘤组织：取新鲜肿瘤组织，每20mg加300μl裂解液（RIPA强裂解液297μl，PMSF蛋白酶抑制剂3μl），充分研磨，然后4℃、12000 r/min离心10min。取上清BCA法测定蛋白浓度，配置12.5%SDS-PAGE分离胶与5%浓缩胶，取20μg蛋白上样，电泳（100V，1.5h），电转（70V，90min），Western blot封闭液封闭1h后分别与β-actin（1:5000，CST公司）、beclin-1(1:2500，Abcam公司）、LC3-Ⅱ（1:2500，CST公司）一抗工作液反应，4℃孵育过夜，再用HRP标记的二抗（1:6000，北京中杉金桥生物技术有限公司）室温孵育1h，运用BeyoECLPlus工作液显色，BIO-RAD ChemiDocTMTouch Imaging System发光成像系统成像。

MFC细胞：取对数生长期的MFC细胞，以每孔1.0×105个细胞密度接种于6孔板中，培养24h待细胞贴壁后进行不同分组药物干预。给药24h后收集细胞，弃培养液，预冷PBS洗两次，每孔加100μl裂解液（RIPA强裂解液99μl，PMSF蛋白酶抑制剂1μl），冰上裂解15min后4℃、12000r/m离心10min。取上清液，BCA法测定其蛋白浓度，配置12.5% SDS-PAGE分离胶与5%浓缩胶，取30μg蛋白上样，其他步骤同组织检测。

7 统计学分析

采用SPSS22.0统计软件，所有数据行单因素方差分析，组间两两比较用LSD检验进行显著性分析，以P＜0.05为有显著性差异。

结 果

1 荷胃癌小鼠及肿瘤组织病理学特点

本研究成功建立荷胃癌615小鼠（图1C）。肿瘤组织切片HE染色显示，细胞核大深染，核质比明显增大，呈现出病理性核分裂像（图1D）。

图1 荷胃癌小鼠及肿瘤组织HE染色。A，小鼠右腋下可见明显肿块（箭头）；B，酒精消毒后剪开右腋皮肤；C，完整剥离肿瘤组织并测量肿瘤长短径；D，肿瘤组织HE染色Fig. 1 Gastric cancer-bearing mice and HE staining of tumor tissues. A, the mouse has a visible mass on the right armpit (shown by an arrow); B, the right skin is cut after alcohol disinfection; C, the tumor tissue is completely dissected and the tumor long and short diameters are measured; D, HE staining of tumor tissue

2 褪黑素体内抑制小鼠胃癌增殖

对不同剂量褪黑素对肿瘤体积的影响观察显示：与对照组相比，两组MLT干预小鼠肿瘤体积均显著降低（图2）。

图2 褪黑素对荷瘤小鼠肿瘤体积影响的统计学分析。* ，0.01＜P＜0.05；n = 8Fig. 2 Statistical analysis for the effect of melatonin on tumor volume in the cancer-bearing mice. *, 0.01＜ P＜0.05; n = 8

3 褪黑素体内诱导肿瘤组织出现自噬形态

透射电子显微镜术观察显示，相比生理盐水处理的MFC荷瘤小鼠，褪黑素组的肿瘤组织中呈现出增多的自噬泡形态，胞质中可见双层或多层膜结构的自噬泡（图3）。

4 褪黑素干预后小鼠肿瘤组织中beclin-1和LC3-Ⅱ水平上调

Western blot检测显示，两组褪黑素干预组胃癌组织beclin-1和LC3-Ⅱ水平均明显高于与对照组（图4），表明褪黑素促肿瘤组织自噬作用。

5 褪黑素抑制小鼠胃癌MFC细胞增殖活性

对细胞形态观察显示，褪黑素单纯干预组和MLT+3-MA联合给药组的MFC细胞的光镜形态明显改变，比正常细胞触角明显缩短，胞体变圆，而单独3-MA给药组的细胞形态无明显改变（图5AD）。细胞增殖活性CCK-8法检测显示，与空白对照组相比，褪黑素单独干预组MFC细胞增殖率显著下降，而单独3-MA给药组的细胞增殖率无明显变化。与MLT单独给药组相比，MLT+3-MA联合给药组MFC细胞增殖率进一步显著下降（图5E）。

图3 肿瘤组织透射电镜观察。A，对照组。B，褪黑素处理组，可见双层或多层膜结构的自噬泡（箭头）Fig. 3 Transmission electron microscopic observation of tumor tissue. A, control group; B, melatonin-treated group, it showed autophagic vacuoles in double-layer or multi-layer membrane structure (arrow)

图4 褪黑素对荷胃癌小鼠肿瘤组织中beclin-1和LC3-Ⅱ表达的影响。A，beclin-1和LC3-ⅡWestern blot检测；B，beclin-1水平统计学分析；C，LC3-Ⅱ水平统计学分析;与对照组比较：*，0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01；n=3Fig. 4 Effect of melatonin on levels of beclin-1 and LC3-II in tumor tissues of gastric cancer-bearing mice. A, Western blot detection for levels of beclin-1 and LC3-II; B, statistical analysis for level of beclin-1; C, statistical analysis for level of LC3-II; compared with control: *, 0.01＜P＜0.05; **,P＜0.01; n=3

图5 褪黑素对小鼠前胃癌MFC细胞增殖活性的影响。A，对照组，肿瘤细胞呈正常形态；B,MLT组,肿瘤细胞触角缩短,胞体变圆； C，3-MA组，与对照组相比细胞形态无明显差别；D，MLT+3-MA联合给药组，细胞触角缩短，胞体变圆；E，细胞增殖率的统计学分析(*，0.01＜P＜ 0.05；**，P ＜0.01；n=3)Fig. 5 Effect of melatonin on the proliferation of murine foregastric carcinoma MFC cells. A, control group, tumor cells showed normal morphology;B, MLT group, antennae of tumor cells was shortened and the cell body became rounded; C, 3-MA group, compared with the control group, there was no signi ficant difference in cell morphology; D, in the MLT+3-MA combined administration group, the cell antenna was shortened and the cell body became rounded; E, statistical analysis for cell proliferation rate (*, 0.01＜P＜ 0.05; **, P＜ 0.01; n = 3)

6 褪黑素体外诱导胃癌MFC细胞出现自噬形态

透射电子显微镜观察发现，MLT处理组MFC细胞中呈现出增多的自噬形态，胞质中可见双层或多层膜结构的自噬泡（图6）。

图6 MFC细胞透射电镜观察。A，空白对照组（低倍）；B，空白对照组（高倍）；C，褪黑素给药组（低倍）；D，褪黑素给药组（高倍），箭头示自噬泡Fig. 6 Transmission electron microscopic observation of MFC cells. A, blank control group (low magni fication); B, blank control group (high magni fication); C, melatonin group (low magni fication); D, melatonin group (high magni fication), arrow showing autophagic vacuoles

7 褪黑素上调胃癌细胞自噬相关蛋白beclin-1和LC3-Ⅱ水平

Western blot检测显示，与空白对照组相比，褪黑素组MFC细胞beclin-1和LC3-Ⅱ水平明显上调，自噬抑制剂3-MA处理组则明显下调，而褪黑素与3-MA联合用药组则与对照组的beclin-1和LC3-Ⅱ水平无明显差异（图7）。

图7 褪黑素对胃癌细胞内beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白水平的影响。A，beclin-1和LC3-ⅡWestern blot检测；B，B, beclin-1蛋白表达水平统计学分析；C，LC3-Ⅱ蛋白表达水平统计学分析;与对照组比较：*，0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01；n=3Fig. 7 Effect of melatonin on levels of beclin-1 and LC3-II in gastric cancer cells. A, Western blot detection for protein levels of beclin-1 and LC3-II; B, statistical analysis for level of beclin-1; C, statistical analysis for level of LC3-II ; compared with control: *, 0.01＜P＜0.05; **, P＜0.01;n=3

讨 论

酵母ATG6同源物beclin-1是自噬体形成的第一步，是自噬的重要引发者之一[11]。酵母ATG8基因的同源物LC3现已作为自噬的特异性标志蛋白［12］，自噬发生时LC3由胞质型（即LC3-I）转位到自噬体膜（LC3-Ⅱ)增加，但LC3-Ⅰ相对不稳定，易受环境及实验条件等多种因素的影响，因此多数研究将LC3-Ⅱ作为自噬检测指标［13-14］。

本实验成功建立了荷胃癌小鼠模型，褪黑素干预组小鼠肿瘤体积明显缩小且CCK-8结果显示MLT组细胞增殖率也明显下降，表明褪黑素在体内外均有抑制胃癌细胞增殖作用。同时，褪黑素干预后，小鼠肿瘤组织和胃癌MFC细胞胞质中均出现了多层膜结构的自噬泡，且细胞自噬相关蛋白beclin-1和LC3-Ⅱ的表达明显上调，证实在褪黑素体内外抑制胃癌细胞增殖过程中，肿瘤细胞自噬表达增强，与前期研究[15]中胃癌细胞凋亡过程中的自噬水平上调相一致。

近年来研究发现[16]，自噬促进胃癌细胞对顺铂(cDDP)的耐药，而自噬抑制剂氯喹(CQ)显著增强胃癌细胞对cDDP的化学敏感性。另有研究表明[17]，姜黄素单独使用诱导胃癌细胞株BGC-823、SGC-7901和MKN-28产生的保护性自噬，可防止细胞大量凋亡，自噬抑制剂3-MA与姜黄素联合使用可显著促进细胞凋亡，从而增强抗癌作用。

为了探究MLT干预后肿瘤细胞自噬水平的升高是起着保护还是促进肿瘤细胞死亡的作用，体外实验通过采用3-MA来阻断自噬，评估其对于MLT抗肿瘤效果的影响。3-MA是一种广泛使用的自噬阻断剂，能阻止自噬体与溶酶体融合而抑制自噬小体的形成［18]。本研究结果显示，MLT+3-MA联合给药组胃癌细胞触角缩短，胞体变圆，且增殖率较MLT组进一步下降，同时，3-MA组的细胞自噬相关蛋白beclin-1和LC3-Ⅱ的表达显著降低。由此说明3-MA能够通过抑制细胞自噬从而增强MLT抑制肿瘤增殖的作用，并提示通过抑制细胞保护性自噬可能会增强肿瘤细胞对褪黑素的敏感性。细胞保护性自噬在褪黑素抗胃癌细胞中所起的具体作用及分子机制有待进一步研究阐明。

综上所述，褪黑素体内外干预后，胃癌细胞增殖抑制且细胞自噬水平上升，可能是肿瘤细胞抵御褪黑素毒性的一种自我保护机制，通过抑制细胞自噬能增强褪黑素的抗肿瘤作用。细胞自噬在褪黑素体内外抑制胃癌细胞增殖过程中起自我保护作用。