Hippo信号通路在肿瘤免疫中的作用

陈庆，朱安平，李正平，王媛，殷焦*，沈关心

（1中国人民解放军联勤保障部队第991医院 441010；2湖北文理学院医学院 襄阳 441053；3华中科技大学同济医学院免疫学系 武汉，430030）

Hippo通路最早在果蝇研究中被发现，主要通过调控细胞的增殖和凋亡，进而控制组织器官生长体积的大小。Hippo通路相关的信号分子亦参与免疫应答反应，在哺乳动物中发挥免疫调节作用等。近年研究发现Hippo信号通路与肿瘤的发生密切相关，成为新的研究热点。Hippo通路在肿瘤的发生中发挥至关重要作用，推测其功能障碍可能是肿瘤发生的初始因素之一。本文就Hippo通路相关信号分子在肿瘤免疫中的作用进行综述，旨在深入了解Hippo通路的重要功能，为其作为临床研究抗肿瘤的潜在靶点提供依据。

1 保守的Hippo信号通路

Hippo通路是组织器官体积大小的保守信号通路，同时还可以调节多种生物学功能，包括细胞生长、控制组织器官体积大小，以及干细胞的自我更新等[1,2]。

在果蝇研究中鉴定的Hippo通路有4个主要激酶 成 分：Hippo（Hpo）、Salvador（Sav）、Warts（Wts）和Mob肿瘤抑制因子（Mats）；其中任何一个成分失活都会促进细胞生长和抑制凋亡，导致细胞无限制增殖。Hpo-Sav形成复合体通过磷酸化Wts-Mats复合体而激活肿瘤抑制通路，有效控制细胞的增殖。果蝇体内Hippo通路的核心是Yorkie （Yki）蛋白，Yki激活后会发生Hpo/Sav-Wts/Mats轴失去效应，导致细胞的大规模增殖[3]；Hpo-sav诱导的Wts磷酸化，继而引起Yki磷酸化，磷酸化Yki增加，滞留在细胞质而无法进入细胞核，使细胞分裂增殖被抑制。

在哺乳动物，Hippo通路每个激酶成分对应的信号分子分别是：MST1/2对应Hpo，SAV1对应Sav，LATS1/2对应Wts，MOB1对应Mats，Hippo信号通路由这4个主要的激酶调控Yes相关蛋白 （Yes-associated protein, Yap）及其旁系同源蛋白TAZ的活性。Yap和TAZ在哺乳动物为肿瘤蛋白，与果蝇的Yki是同源蛋白。

当Hippo通路激活后引起Mst 1/2 活化，与支架蛋白Savl组成复合物使Lats1/2 （large tumor suppressor ; LATS）激酶磷酸化并被激活，与另一支架蛋白Mob1组成复合物，直接使Yap蛋白上S127被磷酸化后产生一个14-3-3的结合基序，与胞浆中的14-3-3蛋白结合而滞留在胞浆中，或进一步被磷酸化后通过蛋白酶体途径被降解[3]。

非磷酸化状态的Yap进入细胞核后，与转录因子结合，发挥其生物学作用。目前公认的转录因子是TEA-domain （TEAD）和p73。核内Yap/TAZ与TEAD结合，促进或抑制TEAD靶基因的表达，如CTGF（connective tissue growth factor，结缔组织生长因子）和Cyr61（cysteine-rich protein 61, 富半胱氨酸肝素结合蛋白61），调节多种生物学功能。例如，发生细胞接触抑制，即当细胞密集接触时，Hippo通路活化，Yap/TAZ磷酸化水平增加、与细胞核隔离，其细胞增殖作用消失；细胞分离时，Hippo通路失活、促进Yap/TAZ迁移至细胞核引导细胞的分裂增殖[4]。Yap/TAZ 是Hippo通路主要的转录辅激活因子，其在细胞核与细胞质之间的位置转移决定Hippo是否被有效激活。

2 Hippo-Yap信号通路与肿瘤免疫

炎症反应的微环境诱导发生有害的突变，使机体发生各类肿瘤的机率大大增加。微环境中的免疫细胞和肿瘤细胞之间一直都在发生相互作用。

研究报道[5]在多种肿瘤组织中发现核内Yap的表达增高，Yap的活性与肿瘤的发生和发展密切相关，肿瘤发生的每个阶段都有过量Yap激活，因此Yap被确定为肿瘤蛋白，与Hippo-Yap通路功能障碍相关所发生的肿瘤称为Yap依赖的肿瘤（Yap-independent cancer）。Hippo通过调控下游蛋白Yap的表达影响肿瘤发生与发展。体外实验报道Hippo信号通路功能失调的肝细胞会发展成恶性肿瘤。

2.1 Hippo-Yap通路与TIC募集巨噬细胞相关

肿瘤发生最初阶段是以单个肿瘤启动细胞（tumor-initiating cell,TIC）存在的时期，活化状态的Yap有助于TIC募集巨噬细胞保护肿瘤细胞、使之免于免疫清除。

正常情况下，TIC微环境中的炎性细胞因子以及IFN等促进树突状细胞成熟、活化以及抗原交叉呈递，扩大并活化效应性CD8＋T细胞克隆，从而确保免疫监视及免疫清除。最近研究[6]发现肝细胞MST1/2缺失会引起相关的Yap过表达，直接并显著增强肝细胞分泌单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein，MCP-1），促进巨噬细胞大量浸润（图1a），M1和M2表型混杂。动物实验中证明，转基因表达过量Yap蛋白，沉默MST1/2或敲除SAV1的小鼠发生肝脏肿大，并最终致肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）发生发展。Yap的去除可抑制MST1/2-dko小鼠MCP1表达，恢复正常的肝脏生长。MCP1是肝细胞中Yap的直接转录靶点，在人肝癌中Yap靶点和MCP-1之间存在强基因表达相关性；肝细胞中的Hippo信号通过抑制Yap依赖的MCP1表达，抑制肿瘤前微环境形成过程中巨噬细胞的浸润，维持正常的肝脏生长抑制HCC增殖，为治疗肝癌提供了新的靶点[6]。

赵斌课题组研究发现肝细胞中Yap的激活诱导集落刺激因子1（colony stimulating Factor，CSF-1）和C-C Motif趋化因子配体2（C-C Motif Chemokine Ligand 2，CCL2）两个趋化因子的表达，招募M2型巨噬细胞至TIC周围（图1b），抑制效应T细胞，促使TIC逃逸免疫监视，避免被清除[7]。因此尽管炎症局部微环境中发生着免疫反应，对于癌细胞却依然如“培养基”般使之“茁壮成长”。Hippo通路的激活抑制Yap-TEAD复合物形成，抑制TIC相关巨噬细胞的招募，减少释放对TIC有保护作用的分子，有助于肿瘤杀伤细胞更加有效的发挥作用。这项研究首次证明巨噬细胞在体内单个TIC的存活中起着决定性作用并为通过靶向Yap或巨噬细胞消除TIC提供了原理证明。

Treg细胞的聚集也在TIC的微环境中介导肿瘤细胞的免疫逃逸。研究发现胃腺癌中Hippo通路成分Lats2、Yap的表达与浸润性Treg细胞计数以及肿瘤Foxp3的表达正相关。Hippo通路通过磷酸化Yap，减少浸润性Treg细胞数量并降低其活性，有助于机体的抗肿瘤免疫，抑制TIC增殖[8]。

2.2 Hippo通路与MDSCs相关

肿瘤细胞最初成功的免疫逃逸导致肿瘤的继续发展，与此同时机体针对肿瘤组织发生免疫细胞的浸润；一部分细胞发挥监视并清除突变细胞的功能，另一部分以髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）为代表的免疫细胞则促进机体产生免疫耐受反应。在有关前列腺癌的研究中发现抑制Hippo通路，Yap-TEAD复合物形成增加，进而上调MDSCs的趋化因子CXCL5的分泌[9]，促进肿瘤细胞微环境中表达趋化因子受体CXCR2的MDSCs的募集，抑制免疫系统对肿瘤细胞的清除（图1c）。Murakami等随后在胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）小鼠模型研究中发现类似结果，且与临床中观察到的PDAC数据一致[10]。Sarkar等在高分化浆液性卵巢癌小鼠模型研究中还发现Yap作用于肿瘤基因PRKCI，进而上调肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor ，TNF-α）的表达，募集MDSCs，抑制细胞毒性T细胞（cytotoxic T cell，CTL）功能[11]。

2.3 Hippo信号通路与PD-L1相关

从单个TIC的形成到发展为恶性肿瘤的整个过程中，Hippo信号通路的抑制有助于肿瘤从宿主免疫监测中逃逸，特别是在Yap相关的肿瘤发生中。参与调节免疫监测的重要分子程序死亡配体1（programmed death ligand，PD-L1），与PD-1的相互作用诱导并维持T细胞耐受，延长肿瘤细胞的存活（图1d）。

在非小细胞肺癌的研究[12]提示Hippo-Yap信号与PD-L1密切相关，细胞核内Yap-TEAD复合物的形成促进肿瘤细胞PD-L1的表达，进而可导致免疫监控系统对恶性肿瘤细胞的失能。在肿瘤组织中Yap和PD-L1表达显著相关，表达高水平PD-L1细胞系中，磷酸化Yap/Yap的比率低，抑制Yap可降低PDL1的mRNA和蛋白水平；Yap基因的强制过度表达提高PD-L1的mRNA和蛋白质水平。染色质免疫沉淀（CHIP）分析使用Yap特异性单克隆抗体导致PD-L1增强子区域的沉淀，包括两个假定的TEAD结合位点。

在人乳腺癌和肺癌细胞系体外模型研究中均证实TAZ和PD-L1蛋白水平的相关性，表明Hippo通路效应因子YAP和TAZ直接上调PD-L1的表达，抑制抗肿瘤T细胞免疫反应[13]。CHIP和荧光素酶检测发现TAZ/YAP/TEAD复合物增强PD-L1 启动子活性，共培养实验证明其在肿瘤细胞免疫逃逸中的具有重要意义。Lee等认为[14]Yap是人类肺腺癌细胞PD-L1表达的转录调控因子；表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor，TKI）的耐药与Yap、PD-L1表达具有相关性；Yap敲除的肿瘤细胞PD-L1表达水平降低；上游调节因子（PI3K、RAF）和Hippo通路中的信号分子（MST1/2, LATS1/2）也可调控PD-L1的表达。Hippo信号可能通过调控PDL1的表达参与免疫逃避。但这种调节机制尚未在小鼠细胞系模型中发现。

Feng等研究证实Hippo信号在人类肺腺癌中的表达受细胞外环境pH值的影响，进而导致TAZ介导的PD-L1上调。在肿瘤乳酸水平和PD-L1表达相关性研究模型中，G蛋白偶联受体 81 （G-protein-coupled receptors, GPR81）通过细胞内cAMP的耗竭启动乳酸诱导的PD-L1上调水平，抑制蛋白激酶A（protein kinase A, PKA），激活Yap/TAZ； Hippo信号通过PD-L1介导局部免疫抑制,重塑肿瘤微环境；Yap/TAZ抑制肿瘤细胞外围的适应性T细胞对肿瘤细胞免疫应答反应；肿瘤细胞可能通过局部微环境中物理、生化刺激Hippo信号调控PD-L1表达以逃避免疫清除[15]。

3 Hippo信号通路中Yap磷酸化存在的争议

Hippo信号通路发挥效应的核心归因于Yap磷酸化，磷酸化的Yap决定Hippo信号是否激活或失效。其他激酶也可调节磷酸化Yap水平和活性。如胞浆中Yap 在S127上磷酸化后使之滞留在细胞质，或进一步被酪蛋白激酶1（casein kinase 1，CK1）磷酸化、并通过蛋白酶体使其降解；在S381上磷酸化会导致Yap的降解；在Y357上磷酸化可诱导细胞凋亡，但在Yes1上的磷酸化会诱导抗凋亡作用[16,17]。细胞所处环境以及磷酸化的位点不同而产生不同效应[18]，因此Hippo-Yap信号通路在某些情况下表现出双重性。

图1 Hippo通路与肿瘤免疫。a，dKO MST1/2诱导Yap依赖的MCP1过表达，促进肿瘤相关巨噬细胞聚集；b，单个肿瘤细胞调节Hippo通路并激活Yap，表达细胞因子并招募II型巨噬细胞，抑制T细胞免疫清除； c，活化的Yap提高了Cxcl5水平，促进MDSCs招募和T细胞抑制；d，Yap通过促进PD-L1的表达使肿瘤细胞逃避宿主免疫监视，抑制细胞免疫Fig. 1 Hippo pathway is involved in tumor immunology. A, dKO MST1/2 induced the Yap-dependent MCP1 overexpression and promoted the aggregation of tumor-related macrophages; b, a the tumor cell can modulate Hippo pathway to activate Yap, and thus express certain cytokines and recruit type II macrophages, which prohibit immune clearance of T cells; c, activated YAP raises Cxc15 level, so MDSCs are recruited and T cells are suppressed;d, Yap promotes the expression of PD-L1 to enable tumor cells to evade host immune surveillance and suppress cellular immunity

对于非Yap依赖的肿瘤研究发现，有研究证明Yap可抵消主导肠组织自我更新和再生的信号通路Wnt/β-catenin通路的促肠组织的再生的作用[2]；在淋巴瘤、骨髓瘤等恶性血液病中Yap通过与p53的同源基因p73相互作用，促进肿瘤细胞发生凋亡[19]。除了Yap，Hippo信号通路的上游成员LATS1/2也表现为两方面的作用[20]：LATS1/2磷酸化Yap，促进其细胞质隔离以及限制细胞增殖；但LATS1/2失活会促发针对自身细胞的免疫反应，进而破坏LATS1/2沉默的相应细胞，维持个体的免疫稳态。

Moroishi等人提出Hippo通路的分子LATS1/2缺失引发抗肿瘤反应[20]：尽管LATS1/2作为Hippo通路中Yap的上游信号分子，通过磷酸化Yap防止核易位，但其敲除后引发的抗癌反应远远强于激活Yap引发的促生长效应。LATS1/2敲除的细胞在体外实验中表现出更强的增殖能力，表明细胞生长的最初并不依赖于Yap过表达或Hippo通路功能障碍。LATS1/2敲除的肿瘤细胞通过分泌更多富含核酸的细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs），进而激活Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）。下游涉及TLRs的内源性核酸通路被激活，进而激活免疫应答，这项研究证明LATS1/2敲除的细胞引导机体发生更强大的免疫反应消灭自身。

4 展望

综上所述，越来越多Hippo通路相关的分子机制的发现拓宽了研究视野，复杂的微环境可能导致Hippo通路作用的多重性，Hippo通路的调节处于动态调节的过程，以调控细胞的增殖与凋亡的平衡，以及内环境的稳定；Hippo信号在不同的环境中发挥不同效应，其详尽机制仍有待探讨。近年来其相关抗癌治疗的药物，例如以Yap为治疗靶点的抗肿瘤药物的开发还处于初级阶段，其应用前景正逐步在扩大；若联合通过阻断T细胞活化共抑制信息分子（co-inhibitory molecules）的癌症监测点阻断（immune checkpoint blockade）免疫治疗，或可成为影响癌症的策略和手段。全面揭示Hippo-Yap信号通路精确的分子调控机制，为临床抗肿瘤治疗研究寻求潜在靶点，为精准治疗药物的研发提供广阔的思路。