锌指结构转录调控因子Sp8 广泛分布于嗅球并在中间神经元表达

贺旭 ，葛金文，宋祯彦，余婧萍

（1湖南中医药大学中西医结合学院，长沙 410208；2益阳医学高等专科学校解剖教研室，益阳 413000）

锌指结构转录调控因子Sp8 是锌指转录家族的重要成员，主要表达在中枢神经系统和四肢[1,2]。作为一种重要的锌指转录结构蛋白，Sp8可调控啮齿类动物嗅球中间神经元的产生，而基因消融Sp8后严重减少生长激素抑制素中间神经元的表达[3]。我们先前研究表明Sp8在大鼠侧脑室室管膜区（SVZ）有广泛表达且可调控该区的神经发生及星形胶质干细胞分化[4]。SVZ区产生的神经祖细胞沿吻侧迁移流以链状方式迁移到嗅球，在嗅球颗粒细胞层（GCL）和突触球层（GL）分化为中间神经元。本文拟进一步探讨Sp8在成年大鼠嗅球各层的分布特点及与嗅球内的中间神经元的关系。

材料和方法

1 实验动物

选择4月龄健康雄性SD大鼠4只，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。所有动物饲养于室温为（23±1）℃，相对湿度为55% 的动物房。整个实验程序都通过湖南中医药大学伦理委员会的批准。

2 主要实验仪器和试剂

珊顿低温冰冻切片机（Shan Don 公司）、Olympus BX67荧光显微镜（奥林巴斯）、鼠抗Sp8 抗体（Santa Cruz公司）、兔抗calbindin（CB）抗体（Sigma公司）、兔抗parvalbumin（PV）抗体（Sigma公司）、兔抗tyrosine hydroxylase（TH）抗体（Sigma公司）。

3 组织学处理

给予SD大鼠麻醉，灌注取出脑组织。4℃后固定过夜，梯度沉糖。恒低温冰冻切片机下采用邻切法进行冠状位切片，切片厚度为6μm。

4 免疫荧光单标染色法

选取6μm切片。PBS-T溶液漂洗3次×5min/次；5%驴血清+0.1%TritonX-100磷酸盐缓冲液室温孵育2h；将脑片与鼠抗Sp8 （1:1000）孵育，4℃冰箱过夜；室温下复温30min，PBS-T溶液漂洗3次×5min/次；Alexa Fluor 488偶联驴抗鼠IgG （1:200）孵育2h；PBS-T溶液漂洗3次×5min/次；双苯酰亚胺（1:5000）染核10min；PBS-T溶液漂洗3次×5min/次；贴片，50%甘油封片，荧光显微镜下观察并选取嗅球部位拍照。

5 免疫荧光双标染色法

选取6μm切片。PBS-T溶液轻微漂洗3次×5 min/次；5%驴血清+0.1%TritonX-100磷酸盐缓冲液室温孵育2h；然后将脑片与以下3组抗体孵育：鼠抗Sp8（1:1000）与兔抗PV（1:1000）；鼠抗Sp8（1:1000） 与兔抗CB（1:1000）；鼠抗Sp8（1:1000）与兔抗TH（1:1000），置于 4℃冰箱过夜；室温下复温30 min，PBS-T溶液轻微漂洗3次，每次5 min；Alexa Fluor 488与Alexa Fluor 594偶联驴抗鼠、驴抗兔IgG（1:200）室温孵育2h；接下来实验步骤同免疫荧光单标染色法。

6 统计学处理

免疫荧光染色片子在目镜×20下拍照，每套片子取相同的部位进行细胞计数，取均值。实验数据以±s表示。细胞比率=（Sp8与中间神经元的共表达细胞/中间神经元）×100%。

结 果

1 Sp8广泛表达于嗅球各层

Sp8免疫阳性细胞在成年大鼠嗅球的嗅神经层（ONL）、突触球层（GL）、外丛状层（EPL）、僧帽细胞层（MCL）、内丛状层（IPL）和颗粒细胞层（GCL）6层中均有分布，阳性反应位于细胞核。其中，主要分布在MCL、IPL和GCL层，而EPL层的阳性细胞数最少（图1）。

2 Sp8表达于嗅球大多数中间神经元

PV和CB阳性中间神经元主要分布于嗅球的EPL层（图2和图4），而TH阳性中间神经元主要分布于GL层（图3）。上述3种类型的中间神经元胞体染色均明显。此外，CB细胞之间还可见到有许多突起并相互联系。细胞计数结果显示，EPL层Sp8/PV细胞与PV细胞的比值为（90.6±7.2）%；EPL层Sp8/CB细胞与CB细胞的比值为（95.4±5.3）%；GL层Sp8/TH细胞与TH细胞的比值为（93.8±9.7）%。

讨 论

嗅觉系统是感觉神经系统的一个重要组成部分，表现为动物依靠嗅觉识别同类、寻找食物、躲避天敌及占有领地，人类则通过嗅觉分辨各种气味。主嗅球（main olfactory bulb, MOB）是嗅觉系统的重要组成部分，为同心排列的层状结构，在嗅觉系统里充当第一级中转站的作用。从内到外嗅球依次可分为6层：颗粒细胞层、内丛状层、僧帽细胞层、外丛状层、突触球层和嗅神经层[5]。

嗅球神经元分为投射神经元和中间神经元两大类，中间神经元的数量大约为投射神经元的100倍。嗅球中间神经元的产生需要神经祖细胞的增殖、迁移和分化，以及新生的中间神经元的成熟及迁移。在侧脑室室管膜区神经干细胞及其直系子代中通过特定转录因子的表达调控神经元的分化，新分化的神经祖细胞通过吻侧迁移流迁移到嗅球且被分化为球周细胞和颗粒细胞。因此了解嗅球神经发生的调控机制有助于我们理解嗅球的神经发育[6]。

研究显示，锌指结构转录调控因子Sp8可与侧脑室室管膜区（SVZ）、海马齿状回颗粒细胞下层（SGZ）及大脑皮层浅层皮质的神经干细胞共表达，因此，Sp8被建议用来标记神经祖细胞[7]。本实验结果显示Sp8主要分布在颗粒细胞层、内丛状层和僧帽细胞层，而在嗅球的嗅神经层、突触球层和外丛状层分布较少。Sp8对嗅球中间神经元的存活、迁移和分子分化起着重要作用，主要表现为敲除Sp8后嗅球内钙网膜蛋白和GABA等中间神经元数量显著减少[8]。此外，SP8还能与Sp9协调管理嗅球中间神经元的发育[9]。因此，我们接着探讨Sp8与中间神经元的共表达情况。根据所表达的化学标记物的不同，嗅球内的中间神经元可分为小清蛋白（PV）细胞、钙结合蛋白（CB）细胞和酪氨酸羟化酶（TH）细胞等[10]。免疫荧光双标结果显示，绝大部分中间神经元都表达了Sp8，这与Li等[11]报道的实验结果一致。

图1 Sp8免疫阳性细胞在成年大鼠嗅球的表达。ONL，嗅神经层；GL，突触球层；EPL，外丛状层；MCL，僧帽细胞层； IPL，内从状层；GCL，颗粒细胞层；标尺，100μmFig. 1 Expression of Sp8-positive cells in olfactory bulb of the adult rats. ONL, olfactory nerve layer; GL, glomerular layer; EPL, external plexiform layer; MCL, mitral cell layer; IPL, internal plexiform layer; GCL, granule cell layer; scale bar, 100μm

图2 成年大鼠嗅球Sp8与PV共表达的免疫荧光双标检测。A，Sp8/PV在嗅球EPL层的分布；B，A中a-c高倍图像；a。-c。， Sp8阳性细胞；a’-c’，PV 阳性细胞；a’’-c’’，a。-c。与 a’-c’融合图像；箭头示双标记细胞；标尺，100μmFig. 2 Double-labeled immuno fluorescent examination for co-expression of Sp8 with PV in the adult rats olfactory bulb. A, the distribution of the Sp8/PV cells in the olfactory bulb EPL layer; B, high magni fication images of a-c in A; a。-c。, Sp8 immunopositive cells; a’-c’, PV immunopositive cells;a’’-c’’ are merged images of a。 -c。and a’-c’; arrows indicate the double-labeled positive cells; scale bar, 100μm

图3 成年大鼠嗅球Sp8与TH共表达的免疫荧光双标检测。A，Sp8/TH在嗅球GL层的分布；B，A中d-f的局部放大图；d。-f。，Sp8阳性细胞；d’-f’，TH 阳性细胞；d’’-f’’，d。-f。与 d’-f’的融合图像；箭头示双标记细胞；标尺，100μmFig. 3 Double-labeled immuno fluorescent examination for co-expression of Sp8 with TH in the adult rats olfactory bulb. A, the distribution of the Sp8/TH cells in the olfactory bulb GL layer; B, local high magni fication images of d-f in A; d。-f。, Sp8 immunopositive cells; d’-f’, TH immunopositive cells; d’’-f’’, merged images of d。-f。and d’-f’; arrows indicate the double-labeled positive cells; scale bar, 100μm

图4 成年大鼠嗅球Sp8与CB共表达的免疫荧光双标检测。A，Sp8/CB在嗅球EPL层的分布；B，A中g-i为局部放大图；g。-i。，Sp8阳性细胞；g’-i’，CB 阳性细胞；g’’-i’’ ，g。-i。与 g’-i’的融合图像；箭头示双标记细胞；标尺，100μmFig. 4 Double-labeled immuno fluorescent examination for co-expression of Sp8 with CB in the adult rats olfactory bulb. A, the distribution of the Sp8/CB cells in the olfactory bulb EPL layer; B, high magni fication images of g-i in A; g。-i。, Sp8 immunopositive cells; g’-i’, CB immunopositive cells;g’’-i’’, merged images of g’-i。and g’-i’; arrows indicate the double-labeled positive cells; scale bar, 100μm

综上所述，锌指结构转录调控因子Sp8在成年SD大鼠的嗅球各层均有分布，且在其大多数中间神经元表达，可能参与了促进嗅球中间神经元的发育分化过程。