靶向蛋白质组学质谱技术在食物过敏原定量检测中的应用

蒋易蓉 任一平 陆柏益*

（1 浙江大学生物系统工程与食品科学学院 杭州 310058

2 浙江清华长三角研究院 浙江嘉兴 314000）

食物过敏是一种过敏人群因摄入某些食物蛋白质而产生不良免疫反应的病理现象，时刻影响着过敏患者的生活质量，甚至危害其生命安全。美国国家过敏和传染病研究所（NIAID）在2010年的食物过敏诊断与治疗报告中称，全球约有1%～10%的人群正遭受食物过敏的威胁，其中儿童的发病率远高于成年人，并且食物过敏在全球的发病率以约18%的速度递增[1-2]。目前，我国针对食物过敏的流行病学调查数据尚不完善，对于中国人群特有的食物过敏原仍处于未知，而食物过敏的发生率与全球的规律具有一定的相似性。黎海芪等[3]曾对重庆地区的婴幼儿开展为期10年的流行病学调查，结果表明在1999年至2009年期间，重庆地区0～1岁婴幼儿中食物过敏的发病率从3.5%上升至7.7%。另有陈静等[4]报道称2009年我国重庆、珠海和杭州3个城市中0～1岁儿童食物过敏的发病率为3.8%～6.4%。

面对日益升高的食物过敏发病率，美国国家过敏和传染病研究所（NIAID）、欧洲变态反应与临床免疫学学院（EAACI）和澳大利亚卫生与福利研究所（AIHW）等相关机构都在食物过敏的流行病学调查、诊断、预防及治疗等领域开展大量调查与研究工作[5]。研究成果表明，避免接触食物过敏原是保护并防止确诊病例再次受到过敏反应危害的唯一有效途径[6]。将食品中的过敏原成分明确标注在标签上，是控制过敏原危害的最有效手段。美国国会于2004年通过了食物过敏原标识与消费者权益保护法案，旨在建立完善的风险管理体系，保障过敏患者的日常膳食与人身安全[7]。目前，我国的食物过敏原标签要求仅为建议标识，而食物过敏原的准确定量检测，是制约食物过敏原风险评估与风险管理的重要瓶颈之一[8]。近年来，基于靶向蛋白质组学与高分辨质谱技术，建立肽段筛选的流程与标准，确定可靠特征肽段作为目标蛋白质的生物标志，开发食物过敏原的检测平台，具有良好的研究与发展前景[9]。

1 食物过敏原准确定量检测的重要性

现有研究数据表明，全球约170种食物均能造成IgE介导的食物过敏反应，而近90%的食物过敏由8大类过敏原引起，分别为牛乳、鸡蛋、大豆、小麦、花生、坚果、甲壳类和鱼类[10]。其中，牛乳和鸡蛋是婴幼儿主要的营养摄入来源，而儿童中牛乳和鸡蛋过敏的发病率分别为0.8%～2.4%和2.8%～4.1%，而80%左右的儿童在4岁以后将不再具有牛乳和鸡蛋过敏症状[11-13]。大豆过敏的发病率相对较低，约有0.3%～0.4%的儿童对大豆过敏[6，11]。花生过敏在白种人中的发病率高，可达1.4%～3.0%[14]。其中Ara h2蛋白可能是与榛子、杏仁等发生交叉反应的主要抗原。甲壳类和鱼类过敏在成人中具有较高的发病率，部分地区可高达17.8%～21.0%[15]。而麦麸过敏的定义仍存在争议，现有研究表明，麦麸过敏引起的肠易激综合征不属于I型超敏反应，为非IgE介导的过敏症状[16]。除8大类过敏原外，还有鸡肉、芝麻、芹菜、茄子、菠萝、苹果、芒果、芥末等不常见的致敏食物近160种[17]。

依据流行病学统计数据可知，常见的8大类食物过敏原为日常膳食的主要构成与营养来源。因此，对于食物过敏患者来说，避免摄入食物过敏原并非易事。研究学者提出，建立食物过敏原风险评估与风险管理平台，是避免过敏消费者意外摄入食物过敏原，保障过敏消费者人身安全与生活质量的重要手段[6]。食物过敏原的风险评估包括危害识别、剂量效应评估、暴露评估与风险特征描述4个步骤，其风险主要来自食品加工过程交叉污染引起的隐蔽食物过敏原，并且针对不同人群其风险引发的危害具有显著差异[18]。剂量效应评估中致敏阈值的确定与暴露评估中市售食品隐蔽过敏原含量的评估是食物过敏原风险评估的重要内容[19]。双盲口服激发试验是确定食物过敏原致敏阈值的唯一标准方法，其试验阳性的最低过敏原摄入水平即为致敏阈值，由口服激发食物中单一过敏原的含量确定，这提出了对食品中食物过敏原准确定量的需求[20]。同时，市售食品中隐蔽食物过敏原含量的测定对食物过敏原准确定量方法的检出限、定量限、准确度和精密度均提出了更高的要求[21]。风险评估是识别危害、认知风险的主要途径，而风险管理是规避风险、预防控制的重要手段。预包装食品针对食物过敏原的标签标识管理，是将风险评估成果转化为风险管理的重要途径。建立完善可靠的食品中食物过敏原的准确定量方法，是支持过敏原标签管理的重要技术手段，是建立健全食物过敏原风险评估与风险管理平台的重要技术基础。

目前，食物过敏原蛋白的定量检测方法主要分为基于目标基因的PCR检测技术，基于目标抗原的免疫学测定技术以及基于目标蛋白特征序列的高效液相色谱串联质谱检测技术。其中，实时荧光定量PCR技术可利用荧光信号实现未知模板的定量分析，特异性强，灵敏度高[22]。然而，由于食物过敏原的致敏成分为蛋白质而非物种DNA，此类通过测定DNA间接定量致敏蛋白的检测方法存在一定的局限性。基于目标抗原的免疫学测定技术可分为酶联免疫吸附试验（ELISA）法、免疫印迹法和免疫层析法等。其中，酶联免疫吸附法利用酶标记的抗体与特异抗原结合，依据颜色反应的强弱实现定性与定量分析，灵敏度高，检测时间短[23-24]。然而，ELISA方法的特异性主要依赖于抗原抗体的特异性结合，而加工食品中致敏原蛋白的结构易因加热、加压等工艺发生结构变化，破坏抗原抗体的特异性结合位点，导致检测结果的假阴性[25]。同时，复杂的食品基质可能含有其它抗原与特异性抗体结合，造成检测结果的假阳性[26]。同基于免疫学原理的免疫印迹法与免疫层析法也存在类似问题。相比较而言，基于目标蛋白特征序列的高效液相色谱串联质谱技术具有良好的应用前景[27]。其将传统的蛋白质组学与质谱定量技术相结合，开发新型的蛋白质准确定量方法，包括鸟枪法蛋白质组学（Shotgun proteomics）、无标记定量蛋白质组学（Label-free quantitative proteomics）与靶向蛋白质组学（Target proteomics）。其中，靶向蛋白质组学在食品中，食物过敏原的准确定量检测中，具有更好的表现[9]。

2 靶向蛋白质组学质谱技术原理及关键步骤

靶向蛋白质组学是把一个复杂体系中所有的目标蛋白质进行精确的定量和鉴定的一门学科，其结合传统蛋白质组学的数据库信息与同位素稀释质谱技术的准确定量能力，实现目标蛋白质的准确定量[28]。目前，靶向蛋白质组学在食物过敏原的定量中，主要采用AQUA（Absolute quantification）定量策略，实现复杂基质中食物过敏原蛋白的准确定量检测。AQUA定量方法的建立主要包括定量肽段的筛选，同位素内标的设计，液相串联质谱采集方法的建立等关键步骤[29]。

2.1 定量特征肽段的筛选

靶向蛋白质组学是利用测序级胰蛋白酶将目标蛋白质组特异性酶切后，通过测定定量特征肽段的摩尔质量，从而准确定量目标蛋白质。测序级胰蛋白酶是一种特异性强、酶切效率高的碱性蛋白酶，特异性酶解位点为赖氨酸与精氨酸的C末端，而当赖氨酸与精氨酸后连接脯氨酸时，其失去酶切能力[30]。针对靶向蛋白质组学的检测步骤与原理可知，定量特征肽段的筛选是决定定量方法是否准确的关键步骤，定量肽段应满足特异性强，酶切效率高，稳定性强，质谱响应高等要求[31]。而针对定量特征肽段的筛选，众多学者提出了相应的筛选策略，包括非实验依赖的计算机预测模型与实验依赖的筛选模型。非实验依赖的计算机预测模型包括 ESP（Enhanced signature peptide）predictor[32]以及PeptidesAtlas[33]等，ESP predictor利用随机森林算法对已知肽段的质谱响应进行聚类分析与回归分析，建立响应最优肽段的预测模型，从而对未知肽段的质谱响应进行预测，实现未知肽段的筛选[32]。而试验依赖的筛选模型主要为基于Skyline软件的数据分析系统，其利用已知数据结果对多目标肽段进行定性与定量分析，并对目标肽段打分，依据分值实现定量特征肽段的筛选[34-35]。PeptidePicker[36]作为一个全面的肽段筛选指南，提出了若干条肽段筛选原则，包括①定量特征肽段具有高度的物种特异性；②定量特征肽段在ExPASy预测软件中具有良好的酶切特性；③定量特征肽段的长度宜在7～20个氨基酸之间；④定量特征肽段具有高度保守性，即在目标蛋白质的所有变异亚型中均存在；⑤定量特征肽段的氨基酸序列中避免出现甲硫氨酸（M）、半胱氨酸（C）、色氨酸（W）等不稳定，易氧化的氨基酸。依据肽段筛选模型、策略与原则，筛选特异性强，酶切效率高，稳定性强，质谱相应高的定量特征肽段，为蛋白质的准确定量奠定良好基础。

2.2 同位素内标的设计

稳定同位素稀释质谱技术是针对复杂食品基质中目标化合物准确定量的重要技术，将已知质量和丰度的稳定同位素加入待测样品中作为内标，校正复杂基质引起的目标化合物在质谱离子化过程中的基质效应[37]。在靶向蛋白质组学的AQUA定量策略中，由于目标化合物为选定的定量特征肽段，因此其对应的稳定同位素为同位素标记的定量特征肽段。目前针对不同的定量需求，具有多种不同的同位素标记策略，主要分为同位素标记肽段的化学合成法与定量特征肽段的同位素衍生法。同位素标记肽段的化学合成法即利用稳定15N，13C同位素标记的氨基酸脱水合成定量特征肽段，得到稳定的同位素标记肽段[38]。而肽段的同位素衍生法有多种选择，包括二甲基衍生法和同位素亲和标签衍生法等。其中，二甲基衍生法是利用肽段游离N末端对甲醛的亲核力，实现N末端上双甲基的衍生化反应，同时，赖氨酸侧链中含有的游离氨基同样具有二甲基衍生化能力[39-40]。当采用稳定同位素标记甲醛作为反应底物时，肽段实现同位素二甲基衍生化，获得同位素标记的定量特征肽段。此方法针对任何定量特征肽段均有衍生化效果，然而由于游离氨基数量的限制，针对不含赖氨酸的定量特征肽段，轻链与重链之间仅有6 amu的质量数差异，针对带两个电荷的肽段来说，只有3个质荷比的差异，这对质谱的分辨率提出较高的要求。同位素亲和标签衍生法[41]是利用同位素标记的生物素-连接子-碘乙酰胺与半胱氨酸侧链的游离巯基反应，实现衍生化效果，其中连接子上带有8个氢原子，均可替代为氘原子，实现轻链、重链8个质量数的差异。然而，此方法只适用于含有半胱氨酸的定量特征肽段，而一般定量特征肽段不建议含有半胱氨酸，因此，此方法在实际应用中存在局限性。目前，食物过敏原定量检测方法中一般均采用稳定同位素标记的合成肽段作为稳定同位素稀释的内标，参与定量特征肽段的准确定量。

2.3 质谱方法的建立

质谱采集方法的确定是实现特征肽段准确定量的重要依据。文献报道的质谱定量采集方法主要分为高分辨质谱采集与低分辨质谱采集。高分辨的质量分析器主要为飞行时间质谱、离子阱质谱和静电场轨道阱质谱等，而低分辨的质量分析器主要为三重四极杆质谱或单四极杆质谱。低分辨质谱的SRM/MRM模式[42-43]，即选择反应监测模式或多反应监测模式，是小分子化合物的经典定量采集模式，其基于三重四极杆串联质谱的采集原理，实现化合物母离子对应子离子的定量采集。相较于选择离子检测模式，多反应监测模式受到基质的干扰更小，基线更低，检测灵敏度更高，准确性更强。随着高分辨质谱技术的日益成熟，采用高分辨质谱采集模式实现食物过敏原定量检测的实例越来越多[44]。然而，与传统母离子/子离子对的串联质谱检测模式不同，高分辨质谱多采用全扫描模式实现目标化合物的定量分析。Monaci等[45]利用静电场轨道阱质谱的全扫描模式的提取离子流图定量检测白葡萄酒中残留的牛乳过敏原，检出限可达0.15～0.7μg/mL。近年来，针对多过敏原的同时检测需求，由于低分辨的SRM/MRM模式与高分辨的PRM（平行反应检测）模式[46]的采集通道较多，操作较为繁琐，有文献报道采用高分辨质谱的DIA模式实现目标化合物的定量分析。DIA模式[47]，即数据非依赖采集模式，可针对一定质荷比范围内的母离子分段进入碰撞池得到其碎片离子的全扫描信息，再经软件对高分辨数据结果进行分析，得到母离子对应子离子的匹配信息与定量结果。此方法可大大提高质谱方法建立的工作效率，而目前未得到广泛的应用与认可。

3 靶向蛋白质组学质谱技术测定食物过敏原

引发IgE介导的食物过敏反应的过敏原均为大分子蛋白质，其包含有易与特异性IgE抗体结合的线性表位，引起I型超敏反应[48]。致敏蛋白主要来自所有8 183个蛋白家族中的27个家族，包括醇溶谷蛋白家族、Cupin蛋白家族、Bet v 1蛋白家族等[49]。大豆过敏原蛋白主要来自Cupin蛋白家族，如7S-球蛋白（β-伴大豆球蛋白）和11S-球蛋白（大豆球蛋白）[50]。Cupin蛋白家族中的致敏蛋白多为高等植物种子的储藏蛋白，包括花生中的Ara h 1蛋白、核桃中的Jug r 2蛋白和芝麻中的Ses i 3蛋白等[51]。而小麦过敏原蛋白中的麦醇溶蛋白和麦谷蛋白属于醇溶谷蛋白家族[52]。牛乳中主要的营养蛋白质均为食物过敏原，包括β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、酪蛋白和牛免疫球蛋白等[53]。同样，鸡蛋中主要的营养蛋白质也均为食物过敏原，包括卵白蛋白、卵类黏蛋白、卵转铁蛋白和溶菌酶等。甲壳类中主要过敏原为原肌球蛋白，在结构上具有高度的保守性，而鱼类中主要过敏原为小清蛋白，是肌肉中的一种钙离子结合蛋白。针对致敏蛋白的分子基础，靶向蛋白质组学质谱技术在食物过敏原的检测中具有良好的应用。

3.1 单一原料中食物过敏原的定量检测

食物中主要过敏原含量的测定是风险评估中双盲口服激发试验必需的检测技术。Johnson等[54]为口服激发试验食物原料中的花生过敏蛋白建立了定量方法，然而，由于其未使用同位素标记方法定量，其定量的准确性不足。Houston等[55]采用AQUA-MRM方法对大豆中10种过敏原进行定量检测，其含量为0.5～5.7μg/mg大豆蛋白。同时，由于大豆品种变化繁多，研究对20个大豆品种中的10种过敏原分别进行准确定量，发现用于定量的特征肽段在20个大豆品种中均能适用，可有效排除品种变异导致的检测结果的不确定性。脂质转移蛋白Zea m 14是玉米中主要的致敏蛋白，而Zea m 14蛋白所在的LTP蛋白家族中具有与Zea m 14序列相似的LTPb和LTPc蛋白。为实现玉米中Zea m 14过敏原的准确定量，Stevenson等[56]利用AQUA-MRM方法筛选出Zea m 14的特征肽段NAAAGVSGLNAGNAASIPSK用于不同玉米品种中Zea m 14蛋白质的准确定性与定量。结果表明，Zea m 14蛋白可与LTPb和LTPc良好区分并分别定量检测，并且在21个不同玉米品种中，Zea m 14蛋白的含量在检出限至30μg/mg蛋白不等，其中5个品种玉米中的Zea m 14蛋白含量低于检出限。牛乳过敏原是人们主要关注的动物过敏原之一。Zhang等[57]利用AQUA-MRM方法对乳清粉和婴幼儿配方乳粉中的α-乳白蛋白进行定量，方法定量限可达10mg/100 g样品。Feng等[58]对牛乳中的α-酪蛋白进行检测，检出限可达0.5mg/L样品。

3.2 复杂加工食品中食物过敏原的定量检测

食品加工过程的复杂性对食物过敏原的定量检测提出了更高的要求。高热、高压、发酵等加工过程均会导致蛋白质三级结构、二级结构，甚至一级结构的变化。利用靶向蛋白质组学质谱技术检测食物过敏原可有效避免过敏原蛋白因三级结构或二级结构变化引起的检测不确定性。Huschek等[59]利用靶向蛋白质组学方法筛选特征肽段，对焙烤食品中大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白和Ses i 6芝麻蛋白建立定量方法，方法回收率为70%～113%，定量限可达10 ppm，然而，由于该方法为使用同位素稀释法，其定量结果有待验证。发酵或酶切的加工过程会导致蛋白质一级结构的破坏，对稳定可靠的特征肽段的筛选提出了更高的要求。Liao等[60]针对“无麸质”的发酵食品建立了小麦和大麦麸质的AQUA-MRM定量检测方法，实现2.5 mg/kg麸质的检出限。其中前期利用Q-TOF质谱技术对发酵食品中的特征肽段进行全面筛选，确定稳定可靠的特征肽段，并合成同位素特征肽段作为内标，实现小麦和大麦麸质的定量检测。

食品加工过程亦可造成不必要的过敏原污染情况，导致隐蔽过敏原现象的发生。红酒中因加工过程需要常加入卵白蛋白或牛酪蛋白作为沉淀剂，而卵白蛋白或牛酪蛋白的残留易造成过敏患者不必要的人身危害。Mattarozzi等[61]利用卵白蛋白、α-酪蛋白和β-酪蛋白的特征肽段实现红酒中微量致敏蛋白的残留检测，检测限可达0.01～0.8 μg/mL样品，其中卵白蛋白的检出限为0.8μg/mL。Pilolli等[62]利用 MSIA D.A.R.T.’STM技术实现卵白蛋白的富集，并利用特征肽段的MRM质谱分析，实现红酒中卵白蛋白的定量检测，检出限可达0.05μg/mL。目前在红酒中的隐蔽过敏原检测均未用到同位素内标，这对前处理要求和基质效应评估提出较高要求。巧克力和曲奇中的花生过敏原也是重要的隐蔽过敏原，在欧洲、美洲等地区受到消费者的强烈关注。Pedreschi等[63]利用靶向蛋白质组学技术实现烘焙曲奇中隐蔽花生过敏原的检测。花生中致敏蛋白的种类繁多，而Ara h 1、Ara h 2和Ara h 3是主要的花生过敏原，其中Ara h 3的丰度最高，占总蛋白含量的21.8%～38.5%。方法筛选Ara h 3的特征肽段AHVQVVD SNGNR和SPDIYNPQAGSLK用于总花生含量的测定，其花生含量的检出限可满足10μg/g样品的要求。Shefcheck等[64]利用Ara h 1中的特征肽段DLAFPGSGEQVEK作为定量标志物，实现巧克力中花生过敏原的定量检测，方法检出限可达2mg花生蛋白/kg样品。

3.3 复杂食品基质中食物过敏原组的定量检测

近年来，已有学者将靶向蛋白质组学技术用于食物中过敏原组的定量分析检测，可有效提高食物过敏原检测效率，实现多过敏原的同时检测。Gu等[65]利用靶向蛋白质组学技术实现了巧克力中牛乳过敏原、大豆过敏原、花生过敏原和坚果过敏原的检测，定量限分别为0.2～0.4μg/g，1.0～4.0 μg/g，2.5～4.0μg/g以及1.0～3.0μg/g。Monaci等[66]针对曲奇复杂基质建立了过敏原组的检测方法，包括鸡蛋过敏原、牛乳过敏原、大豆过敏原、花生过敏原和坚果过敏原。Planque等[67]针对巧克力、冰激凌、番茄酱和曲奇等复杂基质食品建立了牛乳过敏原、鸡蛋过敏原、花生过敏原和大豆过敏原的定量分析方法，其中酪蛋白检出限为0.5mg/kg，乳清蛋白检出限为5mg/kg，花生蛋白检出限为2.5mg/kg，大豆蛋白检出限为5mg/kg，鸡蛋白检出限为3.4mg/kg以及鸡蛋黄检出限为30.8mg/kg。而上述方法采用的特征肽段各不相同，方法间的比较也存在诸多挑战，为更好的解决食物过敏原定量检测的技术问题，应建立并完善靶向蛋白质组学质谱技术的操作标准和评价体系，使其向标准化、规划化的目标更近一步。

4 结语

随着食物过敏的发生率日益增长，食物过敏原的风险评估与风险管理的重要性也不断提高。在传统蛋白质组学技术等生物技术的基础上，结合高灵敏度、高精密度和高准确性的有机质谱技术，开发靶向蛋白质组学质谱技术用于食物过敏原的定量检测，相较于现有基因技术和免疫学技术具有更好的定性和定量分析表现。其方法的建立需要依据目标蛋白质的特点，有针对性的筛选特征肽段，设计同位素内标并建立质谱定量方法，实现并解决已知的科学问题。然而，靶向蛋白质组学质谱技术还未成熟，仍处于发展完善阶段，受到学者们的广泛关注。其特征肽段的筛选标准，同位素内标的设计依据，质谱方法的建立要求都没有标准完善的操作指南。目前，基于现有的AQUAMRM策略已建立多种食品基质中多种过敏原的定量检测方法，然而，方法的准确性与方法间的可比性仍没有良好的评价指标。针对解决食品中食物过敏原准确定量检测的科学问题，建立并完善靶向蛋白质组学质谱技术的标准操作规程，是研究学者们需要共同努力的方向。