复合银离子络合技术在脂质分离分析中的应用

俞喜娜 崔益玮 戴志远 沈 清，2*

（1 浙江工商大学海洋食品研究院 浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室 杭州 310012

2 大连工业大学 海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心 大连 116034）

脂质是一类难溶于水，较易溶于非极性溶剂的生物有机分子。细胞中脂质分子可大致分为3大类：非极性脂质（包括胆固醇、胆固醇酯和甘油三酯）、极性脂质（包括磷脂类、鞘脂类和糖脂类）以及脂质代谢物（指脂质合成或水解过程中产生的物质）。目前，市面上常见的各类脂质营养素在食品相关领域应用广泛，主要包括：长碳链多不饱和脂肪酸，如ARA（花生四烯酸）、DHA（二十二碳六烯酸）、EPA（二十二碳五烯酸）、亚油酸、亚麻酸、生育酚和生育三烯酚、植物甾醇、角鲨烷、磷脂、磷脂酰胆碱、中碳链三甘油酯（MCT）等。

复合银离子技术是基于银离子与不饱和有机物碳碳双键络合反应的分离方法，而且双键越多，络合作用越强，形成的络合物越稳定，在高度不饱和物的分离中具有重要作用，适用于组成成分复杂、回收率要求较高的场所。该技术拥有较强的选择性和重现性，且操作简单、快速，可以很好地改进传统的分离分析技术，为人们开辟了崭新的研究方向。鉴于有关复合银离子在脂质分离分析中系统性研究的文献有限，本文概述银离子与脂质络合机理、银离子提取脂质的方法以及银离子在不同生物样品中的应用的最新研究进展，并对其现存问题及发展前景进行分析，旨在为复合银离子技术的开发利用提供理论依据。

1 脂质的功能与分析方法

1.1 国内外脂质消费市场

以在保健食品、药品等行业被广泛应用的鱼油为例，分析国内外脂质的消费市场。鱼油主要成分为ω-3脂肪酸，是一种多不饱和脂肪酸[1]。鱼油中的EPA和DHA是人体中不可缺乏的物质，能够预防血脂升高以及心血管疾病，防止老年痴呆症、血栓等的形成，然而人类自身无法合成[2]。目前鱼油主要用于水产以及禽畜饲料，作为营养添加剂使用。据国际渔业协会报道，在国际粗鱼油总产量中，仅20%～30%被用于生产各种保健食品、药品，大量的粗鱼油被作为海产养殖业的饲料添加剂。世界各国对鱼油食品开发都非常重视，日本以及欧美发达国家对鱼油保健品的研究起步较早，鱼油加工产业链较为完善，鱼油保健品的消费水平也较高。据美国F&S公司发布的调研报告显示：从2002年至今，国际鱼油市场规模以每年8%的速度增长。2004年，鱼油及其制成品的全球市场销售额为19.4亿美元，到2005年增长到24亿美元，2007年已接近或超过30亿美元。而我国的鱼油加工业发展也比较迅速，2014年我国鱼油原料共出口2.9万t，1.3亿美元[3]，但就国内鱼油保健品的年销售额约在37亿元左右，其中国外品牌产品约30亿元而言，我国鱼油保健品的市场占有率较低，基本被国外的鱼油产品所垄断，我国的当务之急是提高鱼油中EPA、DHA的含量和纯度。

1.2 脂质的营养保健功能

脂质结构的多样性赋予了脂质多种重要的生物功能，它不仅参与调节多种生命活动，而且脂质的异常代谢还与某些疾病，如脑损伤[4]、肝炎[5]、动脉硬化症[6]、糖尿病[7]、肥胖症[8]、冠心病[9]、阿尔茨海默病[10]（Alzheimer disease，AD）、帕金森症[11]以及肿瘤[12]发生发展密切相关。脂质的营养保健功能主要体现在以下几个方面：（1）细胞膜的重要组成部分，是连接极性物质和非极性物质的重要桥梁；（2）细胞和组织的重要结构单元和机体信号物质，以及提供能量的重要来源（3）脂代谢紊乱将导致许多消化系统疾病；（4）脂质在神经系统中履行了多重专一性功能[13]；（5）脂质构成异常可能导致囊泡运输混乱；（6）细胞膜多不饱和脂肪酸水平随年龄增大而趋衰减，可能导致认知功能的损害和记忆衰退；（7）脂质代谢紊乱积累到一定程度可导致机体的病理变化，影响血液循环系统正常生理活动。

不饱和度高的脂质中应用较为广泛的有ARA、DHA、EPA以及亚油酸、亚麻酸。ARA能够促进脑部和神经发育，改善记忆力，预防心血管疾病和癌症。DHA还具有健脑明目，预防心血管病和癌症，抗炎，抑制过敏作用。EPA具有降低胆固醇和甘三酯的含量，降低血液黏稠度，增进血液循环，消除疲劳的作用。亚油酸具有抑制肿瘤生长，减少粥样硬化危险等作用。亚麻酸具有预防心脑血管疾病，降血脂、血压，抑制癌症的发生和转移，抗衰老，增强智力等作用。ω-3脂肪酸可促进副脑的发育和生长，防止风湿性关节炎和冠心病、高血压等[14]。

1.3 脂质结构及目前常规分离分析方法

脂质包括多种多样的分子，其特点是主要由碳和氢两种元素以非极性的共价键组成。通常根据脂质的主要组成成分分为：简单脂质、复合脂质、衍生脂质、不皂化脂类。简单脂质是脂肪酸与各种不同的醇类形成的酯，简单脂质包括酰基甘油酯和蜡。复合脂质（Complex lipids）即含有其它化学基团的脂肪酸酯，体内主要含磷脂和糖脂两种复合脂质。衍生脂质主要包括脂肪酸及其衍生物前列腺素和长链脂肪醇。不皂化的脂质是一类不含脂肪酸的脂质，主要有类萜及类固醇。

脂质的研究技术主要包括脂质的提取、分离、分析鉴定等。近年来对脂质组学分析方法的研究主要有以下几个方面：（1）目标脂质组学，即针对某几类脂质分子进行特定分析；（2）脂质轮廓分析，即全面地分析生物样品内可能含有的脂质类化合物；（3）成像分析，即通过可视化的方法检测生物组织或切片内不同脂质化合物的分布情况[15]。目前已建立的脂质研究方法有很多，主要有薄层色谱法（Thin-layer chromatography，TLC）、气相色谱质谱联用（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、软电离质谱技术、“鸟枪法”和核磁共振法（Nuclear magnetic resonance，NMR）等。其中软电离质谱技术包括基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱（Matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF/MS）法和电喷雾电离质谱（Elec trospray ionization mass spectrometry，ESI-MS）法[16]。

薄层色谱法是最早应用的方法，也是最简单的脂质分离方法。它的优点是比较直观、快捷，分离效率较好且相对较为经济。其缺点是只能分析挥发性的有机化合物，不挥发性的化合物用此法之前需进行水解或衍生化，而且需要的样品量比较大，测定灵敏度和分辨率都比较低，TLC板上面的斑点在切除过程中易发生不饱和脂类氧化，破坏部分脂类结构，这些缺点限制了TLC在复杂的脂质分子上的深入应用。

气相色谱质谱联用适用于检测分子质量小于500 u的脂质分子[17]，具有良好的分离效率且价格便宜。缺点是实际分析中测定的定酯化的脂肪酸脂质sn-1、sn-2酰基位的脂肪酸链的位点信息在测定过程中丢失，且样品衍生化处理过程不仅耗费时间，还需要大量样品，并易引起样品变化，因此其在分析较为简单的脂肪酸上应用较多。

软电离质谱技术较为成熟，其特征是可使生物分子在无碎片断裂的情况下进行分离。优点一是可不经过衍生化而直接对高分子量和不挥发性的混合物进行检测；二是被分析物种的碎片少，利于对样品混合物的解析。电喷雾电离质谱是脂质分析中应用最多的软电离质谱法，该法通过正离子或负离子扫描得到生物样本中脂质的全谱来进行定量分析脂质。此方法前处理比较简单，灵敏度高，用时短且所需样品量少，适用于大多数脂质的定量分析。其缺点是分析丰度较低的脂质较为困难，且用该法须加入不挥发性的Li+作为缓冲剂，易导致离子源污染，使质谱仪的使用寿命缩短。基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱在组织切片的脂质分析中应用较多，其基本原理是将目的样品混合或涂上固体基质，便会出现特殊的吸收峰，这种方法的优势在于不需要对酶类进行纯化处理[18-21]。

“鸟枪法”在电喷雾电离质谱技术基础上进行了改进，其原理主要是源内分离（Intra source separation），即根据脂质分子在不同pH值条件下有不同的带电倾向，通过调整样品的pH值，改变脂质分子的离子化倾向，并结合ESI正、负离子检测模式的切换，达到离子化过程中分开检测不同脂质分子的目的[22]。鸟枪法样品无需预分离即可直接质谱进样，操作简单快捷，灵敏度高，结果稳定可靠。

2 银离子与脂质络合原理

银离子络合萃取法是基于银离子与不饱和有机物碳碳双键络合反应的分离方法，具有较强的选择性，然而其适应范围比较窄。

Ag是IB族元素，外围电子构型为4d105s1，易失去电子而呈现+1价氧化态。目前对于银离子与碳碳双键成键的解释，普遍采用Dewar-Chatt-Duncan-son模型（DCD模型）。此模型认为银离子与碳碳双键的成键包括以下两个方面：一方面是碳碳双键向银离子提供电子，即碳碳双键π轨道与银离子的5s空轨道形成σ键；另一方面银离子向碳碳双键的π*轨道反馈电子，即银离子的4d轨道与碳碳双键的π*反键轨道重叠，由银离子的4d轨道向碳碳双键的π*反键轨道流入电子，从而形成π键。

碳碳双键的π键给电子的能力较弱，不易形成稳定配合物，由于反馈π键和σ配位键的成键作用，银离子与碳碳双键配合物得以稳定存在。作为过渡金属元素，失去5s1这一外层电子后，正一价的银离子具有d10的电子构型，从而与碳碳双键形成非常稳定的配合物[23]。

3 基于银离子络合的方法

3.1 银离子液液萃取

银离子溶液液液萃取的选择性较强，液液萃取根据相似相溶原理，依目的物的极性不同选择适宜的溶剂，有不同极性的溶剂可供选择，例如：石油醚这类非极性溶剂，水这类强极性的廉价溶剂，因此可解决很多实际问题，且萃取过程中的选择性较好，效率高。另外银离子溶液液液萃取可以得到常规技术难以得到的高纯度产品，络合反应条件较为温和，分离简单，为工业生产提供了一定的理论依据。

邱榕等[24]利用DHA乙酯与银离子络合物的紫外光谱，观察光谱特征峰在络合前、后的移动规律，研究了银离子络合物萃取DHA乙酯的络合机理，发现与络合前相比较，DHA乙酯与银离子络合物的最高占据轨道和最低空轨道之间相对能量差变大，位于络合物外层的价电子能级间距离增大，电子跃迁需要更多的能量。陈钧等[25]研究了用银离子络合法萃取典型不饱和有机物的一般规律和用此法萃取高纯度浓缩鱼油中的活性成分，结果显示在有机物碳原子数与双键数（或大π键数）之比小于等于6且无空间位阻的情况下，络合萃取的概率较高，银离子络合法可较好地分离鱼油中航的活性成分。张磊等[26]研究了银离子络合萃取虾青素的工艺条件，发现萃取剂极性、萃取温度和Ag+对虾青素的萃取有较大影响，结果表明0℃时，用含饱和Ag+的甲醇∶水（9∶1，体积比）溶剂萃取含60%虾青素的石油醚提取液，虾青素纯度提高至74%，回收率为92%。Dillon等[27]使用银硫醇固定相对单-，二-和三-甘油酯进行高效液相色谱分析，研究表明，这种方法可以从单一色谱图得到关于脂肪质量（不饱和度，反式脂肪酸）的基本信息，银在固定相上是共价键合的复合物，这大大提高了HPLC柱的稳定性和耐久性以及分离结果的一致性。Kubota等[28]使用微孔疏水性中空纤维膜提取器，用硝酸银水溶液进行多不饱和脂肪酸的乙酯如二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的溶剂萃取，结果显示渗透速率通过中空纤维的内侧和外侧的膜和层状边界层的扩散来控制。Teramoto等[29]研究了利用硝酸银溶液从不同有机溶剂中提取多不饱和脂肪酸（PUFA），发现随着温度的降低，多不饱和脂肪酸乙酯在硝酸银萃取相和溶于庚烷的有机相之间的分布比显著增加。

3.2 银离子固相萃取

不同于一般的气相色谱定量检测反式脂肪酸，检测对象局限于植物油、乳品和婴幼儿食品而不适用于含有动物油脂的食品，银离子固相萃取扩大反式脂肪酸国标方法的适用范围，提高了食品中反式脂肪酸检测的科学性，具有较高的稳定性和精密性，且操作简单、快速，有较好的重现性，对环境造成的污染也较小。

王涛等[30]研究了银离子固相萃取结合气相色谱对食品中反式脂肪酸的检测效果，结果表明此方法具有较高的灵敏度和较好的分离效果，可避免顺式和反式脂肪酸干扰，在肉类、乳类等制品中有较好的适用性，且得到的反式脂肪酸的含量更加准确。李蕊等[31]利用银离子固相萃取结合气相色谱分离了亚油酸、亚麻酸、反式脂肪酸，并检测了乳脂肪中含有的反式脂肪酸，发现该方法既能准确检测样品中反式C18：1、C18：2的含量，也能测定反式C18：3含量。李冰宁等[32]用银渍硅胶固相萃取柱离线净化，程序升温进样-气相色谱-氢火焰离子化检测器的方法对巧克力中的饱和烷烃矿物油进行了定量分析，发现此方法的检出限低，适用于巧克力中MOSH的测定，能很好的检测巧克力中矿物油的污染情况。Christie等[33]用银离子柱通过高效液相色谱分离三酰基甘油的分子种类，该试验在银离子柱上获得了优异的分辨率，不会使银离子成分被污染，同时色谱柱稳定，活性保持时间较长。Dreiucker等[34]使用银离子固相萃取，然后以选择的离子监测（SIM）模式运行的GC/EIMS进行了全面分析和比较了养殖骆驼、驼鹿和牛与一个人乳样品，结果表明，人乳的反式脂肪酸和支链脂肪酸的含量较低，此方法可能有助于建立更全面的数据库。

3.3 银离子流动注射纯化

银离子流动注射纯化大致有以下几个优点：所需要的仪器设备结构较简单，操作简便易于连续分析，精密度较高，试剂用量少且有较大的适用性，可以完成复杂的分离萃取操作[35]。

Shanmugam等[36]在10℃条件下，在1.59mm微流体系统和65mL批量搅拌反应器中利用50%的硝酸银溶液从18/12的原鱼油中液液提取EPA/DHA，结果发现在这种微型接触系统中所观察到的流动模式与之前在这项方法上的研究结果存在显著不同，分层流域系统的存在可能会导致每个阶段不同的间隙速度，从而在有机相和水相的停留时间内产生意想不到的差异。

3.4 银离子分子筛

分子筛是近几年来出现的一门新兴分离技术，分子筛具有网状多孔结构，因此具有较高的吸附容量，而且还具有分子选择吸附的性能，在高温高压下可将分子直径较大的气体分子强制压入银离子分子筛中。利用银离子来调节分子筛吸附剂的吸附性能力，因为双键数目多，与银离子结合的能力就越强，而且硝酸银的浓度对修饰反应的影响最小。

郝六平[37]在超临界条件下用银离子修饰的13X分子筛分离鱼油中的DHA和EPA单组分，研究了压力、温度和鱼油的流量对纯度的影响，结果表明运用此方法将EPA和DHA的纯度分别从20.4%和12.7%提高到88.4%和84.3%，收率分别为46.0%和35.5%。Ecknig等[38]分别对钾离子和银离子在分子筛腔内分步交换钠离子的不同选择性制备了X型分子筛，并对石蜡烯烃的选择性进行了研究，选择了最合适的分子筛用于计量石油内的成分。

4 复合银离子络合技术的应用

4.1 动物油脂

目前常见的银离子分离动物性油脂有鱼油这类海洋性哺乳动物油和乳类脂肪。鱼油中所含的二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸有很多对人体有益的生理活性，因而成为研究热点。动物油脂的脂肪酸种类较多，含有大量长链多不饱和脂肪酸。

江莉莉等[39]通过响应面优化法优化银离子络合法提取鱼油乙酯中EPA及DHA的最佳工艺，结果显示，硝酸银的浓度、料液比、解离温度与转移率存在显著的相关性，最佳工艺条件为硝酸银浓度4.9moI/L，络合温度0℃，料液比 1∶3.76，解离温度51℃，解离时间30min，EPA和DHA的最高理论转移率为62.8%。鲁仲辉等[40]采用了尿素脂肪酸包合结合银离子硅胶色谱技术分离以获得高纯度蚕蛹α-亚麻酸，结果显示，脂肪酸/尿素质量比对包合效果的影响最重要。刘卓华等[41]利用硝酸银络合法浓缩金枪鱼鱼油混合脂肪酸中的多不饱和脂肪酸，结果表明在搅拌时间为60min，硝酸银浓度为4mol/L条件下得率为18.03%，其中含有EPA和DHA质量分数为9.78%和86.07%。张金廷[42]编写的脂肪酸加工手册中写到利用硝酸银络合法处理金枪鱼眼窝的脂肪酸乙酯所得到的乙酯纯度较高。Adlof等[43]采用饱和银离子的XN1010树脂柱分离多种鱼油脂肪酸和酯样品中高度不饱和的ω-3组分，在分离过程中添加丙酮腈，得到ω-3组分含量为82%～99%，运用此方法较为简单快速。

4.2 植物油脂

利用银离子络合技术对植物油脂进行处理，不仅拓展了银离子络合技术在植物方面的应用领域，提升了植物油脂的附加价值，并解决了一些动物油脂中提取物资源稀缺的问题，实现了植物油脂中有益提取物的规模化生产，也为研究植物油脂提取方法提供了新思路。

姚忠等[44]利用银离子络合技术络合萃取山茶油中的角鲨烯，提高了角鲨烯的得率，而且银离子络合的高选择性实现了分离操作的简化，获得了纯度较高的角鲨烯。王昌禄等[45]以活化的银化硅胶作为固定相，采用银化硅胶柱层析提取红花籽油中的亚油酸，解决了一般富集纯化多不饱和脂肪酸方法中所存在的难以得到纯度较高产物的问题。陈文利等[46]研究了银离子络合萃取法纯化不饱和脂肪酸的方法，成功地分离了油脂中花生四烯酸等活性成分，结果表明经络合萃取后，花生四烯酸的纯度由15.14%提升到51.69%，收率为97.15%。陈晓等[47]探讨了分离纯化茄尼醇的方法，结果表明银离子络合萃取法是分离茄化醇的有效方法，当硝酸银浓度为4mol/L，络合2次后，得到的茄尼醇的纯度为89.9%，收率为92.1%，且银离子络合的方法所需要的条件也较为简单，降低了有机溶剂的消耗和茄尼醇提纯的工业成本。葛双双等[48]利用银离子络合法分离纯化了余甘子核仁油中α-亚麻酸，提高了α-亚麻酸的纯度，结果显示由于硝酸银可重复利用，此方法降低了络合工艺的操作成本，得到的产品不含银离子，较为安全，该络合反应在低温条件中进行，更好地保证了α-亚麻酸的活性。

4.3 生物体内物质

银离子具有电荷吸附作用，利用银离子处理生物体内物质，具有方法简单，重现性较好的特点，而且可通用于其它化合物的检测。杨芹等[49]利用银离子高效液相色谱-质谱法分析了血清中甘油三酯类化合物的组成，在小鼠血清的脂质提取物中鉴定出了66个甘油三脂类化合物和5个胆固醇类化合物，提供了TAG组成的具体信息，这是酶解法所做不到的。吴拥军等[50]利用银离子对蛋白质内的巯基的吸附作用，研究了银离子选择性电极测定血清中蛋白质这一方法，结果显示此方法中的pH值和温度对测定样品中蛋白质含量的准确度存在很大影响。董春凤等[51]研究了B族维生素联合银离子敷料治疗心脏手术后切口脂肪液化的疗效，还研究了其对肉芽组织生长的影响，研究表明银离子敷料以及局部注射B族维生素使肉芽组织的形成加快，缓解了局部炎症，使心脏手术后的切口脂肪液化部分愈合。

5 结论与展望

本文结合近几年来银离子络合的相关文献，综述了关于复合银离子络合技术在脂质分离分析中的研究现状。随着我国经济的发展，居民生活水平逐渐提高，对保健食品，例如：富含EPA和DHA的鱼油的重视度越来越高，选择合适的方式对脂质进行分离、分析日渐成为研究的热点。

在银离子液液萃取中，此法可获得传统方法所做不到的高纯度样品，而且反应条件相对较为温和，不需要增加特殊设备的投入量，试验过程中所用到的硝酸银可回收重复利用。采用电解法回收，相对于常用的柱层析方法成本较低，且操作简单，反应时间也较短，不需要加入很多有机溶剂，可适用于脂质大批量的提纯，具有较为广阔的应用前景[52]。同时也存在一些不足之处，例如：影响银离子液液萃取的因素较多（料液比、温度、硝酸银的浓度等）。因此试验设计要合理，而且银离子遇到多烯的有机物或光容易被还原成银，硝酸银价格较贵，还具有腐蚀性。在银离子固相萃取中，例如：对结构甘油三酯的同分异构体进行分离测定，此法可有效分离其同分异构体并准确定量，为结构脂质的性能评价和开发创新提供了一定的依据。银离子固相萃取有较高的稳定性及精密度，而且性能稳定，同时避免饱和和顺式脂肪酸对反式脂肪酸检测的干扰。缺点是可能延长了实际操作时间，需根据实际情况进行选择。银离子流动注射纯化和银离子分子筛是新兴的脂质分离技术，目前国内外关于这些技术的研究报道较少。

总而言之，复合银离子络合技术基于银离子与碳碳双键的络合反应，拥有较好的选择性，可提高分离产物的产量和纯度，为脂质分离、分析提供了一个崭新的视角，并为其开辟了一个较新的研究领域，具有较大的潜力及研究意义。