脱胶葵花盘醇溶物提取工艺优化及抗氧化活性研究

包小兰，袁兴宇，李 欢，朝鲁巴根，韩 博

(1.内蒙古农业大学 食品科学与工程学院，呼和浩特 010018； 2.内蒙古国际蒙医医院， 呼和浩特 010065)

油葵作为主要油料作物之一在我国被广泛种植[1]。长期以来，秋收后的油葵除葵花籽用作榨油外其余成分均未被有效利用，如葵花盘几乎被废弃，当作牲畜饲料或垃圾焚烧，不仅污染环境还造成资源浪费[2-3]。葵花盘的利用近年来逐渐被重视，葵花盘富含一些活性物质如多糖、绿原酸、果胶、多酚、黄酮等[4]，对于其果胶及绿原酸的提取技术目前已较为成熟[5]，但对葵花盘中一些醇溶物如多糖、多酚、黄酮的研究不甚详尽，其有效生物活性的开发更是少之甚少。现阶段对于葵花盘中果胶的提取已经投入商业生产且初见规模，随之废弃的大量脱除果胶后的葵花盘渣，造成了巨大的浪费[6-8]。为此，本文以脱胶葵花盘渣为原料，探讨脱胶葵花盘醇溶物提取工艺及抗氧化活性，为脱胶葵花盘的进一步开发利用提供参考，提高葵花籽工业副产品资源利用率和综合经济效益，为新型功能性食品开发应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

脱胶葵花盘渣，内蒙古康斯特生物科技有限公司；ABTS、DPPH，美国Sigma公司；氢氧化钠、盐酸、乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、苯酚、无水碳酸钠、福林酚试剂、三氯化铁、三氯乙酸、硫酸亚铁、水杨酸、过硫酸钾，天津市风船化学试剂科技有限公司。

1.1.2 仪器与设备

TDL-5-A型飞鸽牌系列离心机，LCJ-25C型冷冻干燥机，AL204型电子天平，PHSJ-4A型实验室pH计，HJ-6型数显恒温磁力水浴锅，HJ-1型磁力搅拌器，GZX-9140 MBE型数显鼓风干燥箱，FS-150型超声波处理器，UV-5500 PC 型紫外可见分光光度计。

1.2 实验方法

1.2.1 脱胶葵花盘醇溶物的提取

将脱胶葵花盘渣用高速粉碎机粉碎，与蒸馏水混合均匀，4 000 r/min离心15 min收集沉淀，30℃烘干后粉碎过60目筛，得脱胶葵花盘粗粉。称取该粗粉，按一定比例与一定体积分数的乙醇溶液混合，超声波辅助处理一定时间后在一定温度下搅拌浸提，浸提结束后4 000 r/min离心20 min，取上清液浓缩后真空冷冻干燥获得醇提物，于密封袋4℃保存备用。以醇提物得率及其质量浓度为1 mg/mL时的DPPH自由基清除率为指标进行工艺优化。按下式计算醇提物得率。

醇提物得率=醇提物质量/脱胶葵花盘粗渣质量×100%

1.2.2 脱胶葵花盘醇提物抗氧化活性分析

1.2.2.1 DPPH 自由基清除率的测定[9]

取1 mL不同质量浓度的脱胶葵花盘醇提物溶液，依次加入1 mL DPPH溶液(0.1 mmol/L，95%乙醇配制)充分混匀，室温避光静置30 min，517 nm测定吸光值；用1 mL 95%乙醇溶液代替DPPH溶液为样品参比组；空白组为1 mL的DPPH溶液与1 mL的95%乙醇溶液。DPPH自由基清除率根据下式进行计算。

DPPH自由基清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

式中：Ai为样品组吸光值；Aj为样品参比组吸光值；A0为空白组吸光值。

1.2.2.2 羟自由基清除率的测定[10]

取1 mL不同质量浓度的脱胶葵花盘醇提物溶液，加入0.3 mL FeSO4、1 mL水杨酸、0.25 mL H2O2，混匀后37℃下水浴30 min，再加入0.45 mL蒸馏水离心，取上清液在510 nm处测吸光值。设置空白组。羟自由基清除率按下式计算。

羟自由基清除率=(A0-Ai)/A0×100%

式中：A0为空白组吸光值；Ai为样品组吸光值。

1.2.2.3 ABTS自由基清除率的测定[11]

将5 mL 7.4 mmol/L的ABTS溶液与88 μL 2.6 mmol/L的过硫酸钾混匀后室温放置16 h，配制成ABTS工作液，室温条件下波长734 nm处吸光值为0.70±0.02。0.2 mL ABTS工作液与10 μL不同质量浓度的脱胶葵花盘醇提物混合后静置6 min，在734 nm处测定吸光值。ABTS自由基清除率按下式计算。

ABTS自由基清除率=(A0-Ai)/A0×100%

式中：A0为空白组吸光值；Ai为样品组吸光值。

2 结果与分析

2.1 脱胶葵花盘醇溶物提取的单因素实验

2.1.1 料液比对醇提物得率及其DPPH自由基清除率的影响

取脱胶葵花盘粗粉，分别以1∶8、1∶11、1∶14、1∶17、1∶20的料液比，加入体积分数为60%的乙醇溶液，搅拌均匀后超声波处理15 min，50℃下恒温搅拌提取1.0 h。测定醇提物得率及其DPPH自由基清除率，结果如图1所示。

图1 料液比对脱胶葵花盘醇提物得率及其DPPH自由基清除率的影响

由图1可知，当料液比从1∶8增加到1∶17时，脱胶葵花盘醇提物得率和DPPH自由基清除率一直处于上升状态，当料液比为1∶17时，脱胶葵花盘醇提物得率达到最大值(19.94%)，DPPH自由基清除率也达到最大值(69.27%)。但当料液比从1∶17增加到1∶20时，脱胶葵花盘醇提物得率及DPPH自由基清除率分别下降至18.11%和68.11%。在此反应体系中，料液比过高或过低都不利于醇溶物的提取。因此，脱胶葵花盘醇溶物提取的最适料液比为1∶17。

2.1.2 超声波处理时间对醇提物得率及其DPPH自由基清除率的影响

取脱胶葵花盘粗粉，以1∶17的料液比加入体积分数为60%的乙醇溶液，搅拌均匀后超声波分别处理15、30、45、60、75 min，50℃下恒温搅拌提取1.0 h。测定醇提物得率及其DPPH自由基清除率，结果如图2所示。

图2 超声波处理时间对脱胶葵花盘醇提物得率及其DPPH自由基清除率的影响

由图2可知，当超声波处理时间从15 min延长至30 min时，醇提物得率和DPPH自由基清除率均呈上升趋势，当超声波处理时间为30 min时，脱胶葵花盘醇提物得率达到最大值(17.21%)，同时，DPPH自由基清除率也达到最大值(70.91%)，当超声波处理时间从30 min延长至75 min时，脱胶葵花盘醇提物得率及DPPH自由基清除率均呈下降趋势。因此，脱胶葵花盘醇溶物提取的最适超声波处理时间为30 min。

2.1.3 乙醇体积分数对醇提物得率及其DPPH自由基清除率的影响

取脱胶葵花盘粗粉，以1∶17的料液比加入体积分数分别为60%、65%、70%、75%、80%的乙醇溶液，搅拌均匀后超声波处理30 min，50℃下恒温搅拌提取1.0 h。测定醇提物得率及其DPPH自由基清除率，结果如图3所示。

由图3可知，当乙醇体积分数从60%增加到70%时，醇提物得率从10.88%上升到15.31%，DPPH自由基清除率从62.49%上升到70.57%，当乙醇体积分数从70%增加到80%时，醇提物得率及DPPH自由基清除率均下降。因此，脱胶葵花盘醇溶物提取的最适乙醇体积分数为70%。

图3 乙醇体积分数对脱胶葵花盘醇提物得率及其DPPH自由基清除率的影响

2.1.4 浸提温度对醇提物得率及其DPPH自由基清除率的影响

取脱胶葵花盘粗粉，以1∶17的料液比加入体积分数为70%的乙醇溶液，搅拌均匀后超声波处理30 min，分别在20、35、50、65、80℃下恒温搅拌提取1.0 h。测定醇提物得率及其DPPH自由基清除率，结果如图4所示。

图4 浸提温度对脱胶葵花盘醇提物得率及其DPPH自由基清除率的影响

由图4可知，当浸提温度从20℃升至50℃时，醇提物得率及DPPH自由基清除率均处于上升趋势，醇提物得率从11.87%上升到18.23%，DPPH自由基清除率从65.44%上升到70.92%。当浸提温度从50℃升至80℃时，醇提物得率及DPPH自由基清除率均呈下降趋势。因此，脱胶葵花盘醇溶物提取的最适浸提温度为50℃。

2.1.5 浸提时间对醇提物得率及其DPPH自由基清除率的影响

取脱胶葵花盘粗粉，以1∶17的料液比加入体积分数为70%的乙醇溶液，搅拌均匀后超声波处理30 min，50℃下分别恒温搅拌提取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h。测定醇提物得率及其DPPH自由基清除率，结果如图5所示。

由图5可知，当浸提时间从0.5 h延长至1.0 h时，醇提物得率及DPPH自由基清除率均处于上升趋势，醇提物得率从13.01%上升到16.19%，DPPH自由基清除率从64.62%上升到69.13%。当浸提时间从1.0 h延长到2.5 h时，醇提物得率及DPPH自由基清除率均呈现缓慢下降的趋势。因此，脱胶葵花盘醇溶物提取的最适浸提时间为1.0 h。

图5 浸提时间对脱胶葵花盘醇提物得率及其DPPH自由基清除率的影响

2.2 脱胶葵花盘醇溶物提取的正交实验

按照单因素实验结果，选择浸提温度(A)、浸提时间(B)、超声波处理时间(C)、料液比(D)、乙醇体积分数(E)进行五因素四水平正交实验，确定醇溶物最佳提取工艺。正交实验因素水平见表1，正交实验结果与分析见表2。

表1 正交实验因素水平

表2 正交实验结果与分析

续表2

实验号ABCDE得率/%DPPH自由基清除率/%DPPH自由基清除率k164.0064.2666.0765.3665.63k265.6169.0968.3567.3866.72k365.7665.6762.7265.1466.55k468.9465.2867.1666.4365.41R4.944.835.632.241.31

由表2可知，5个因素对醇提物得率的影响程度顺序为浸提温度>浸提时间>超声波处理时间>乙醇体积分数>料液比，最佳组合是A4B2C2D2E2，5个因素对醇提物的DPPH自由基清除率的影响程度顺序为超声波处理时间>浸提温度>浸提时间>料液比>乙醇体积分数，最佳组合是A4B2C2D2E2，与醇提物得率的最佳提取工艺条件一致。即本实验醇溶物的最佳提取工艺条件为浸提温度60℃、超声波处理时间30 min、料液比1∶17、乙醇体积分数70%、浸提时间1.0 h，经验证，在此工艺条件下脱胶葵花盘醇提物得率达到20.32%，DPPH自由基清除率达到72.13%。

2.3 脱胶葵花盘醇提物的抗氧化活性

2.3.1 脱胶葵花盘醇提物质量浓度对DPPH自由基清除率的影响

DPPH自由基是一种以氮为中心的稳定自由基，常被用来评价抗氧化剂对自由基的清除能力，对DPPH自由基的清除效果可反映抗氧化剂的供氢能力[12-13]。分析了脱胶葵花盘醇提物的DPPH自由基清除率，结果如图6所示。

图6 脱胶葵花盘醇提物的DPPH自由基清除率

由图6可知，随着质量浓度的升高，脱胶葵花盘醇提物DPPH自由基清除率呈上升趋势，但低于相同质量浓度VC的DPPH自由基清除率。VC对DPPH 自由基的清除能力始终保持在较高水平。当质量浓度为0.8 mg/mL时，脱胶葵花盘醇提物的DPPH自由基清除率为50.03%，VC的DPPH自由基清除率为90.69%；当质量浓度为1.6 mg/mL时，脱胶葵花盘醇提物的DPPH自由基清除率为81.02%，VC的DPPH自由基清除率为95.82%，两者的差距明显缩小。可见随着质量浓度的升高，脱胶葵花盘醇提物的DPPH自由基清除率逐渐接近VC。

2.3.2 脱胶葵花盘醇提物质量浓度对羟自由基清除率的影响

羟自由基可通过细胞膜与脂质、DNA以及蛋白质等生物大分子对组织造成损伤，或引起氧化损伤[14]。脱胶葵花盘醇提物的羟自由基清除率如图7所示。

图7 脱胶葵花盘醇提物的羟自由基清除率

由图7可知，脱胶葵花盘醇提物对羟自由基有一定的清除作用，但清除能力低于VC。当质量浓度为0.8 mg/mL时，脱胶葵花盘醇提物的羟自由基清除率为25.52%，VC的羟自由基清除率为79.68%；当质量浓度为1.4 mg/mL时，脱胶葵花盘醇提物的羟自由基清除率为48.22%；当质量浓度为1.6 mg/mL时，脱胶葵花盘醇提物的羟自由基清除率为49.58%，VC的羟自由基清除率为97.69%，表明质量浓度为1.4 mg/mL时，脱胶葵花盘醇提物羟自由基清除率已经达到较高值，继续提高质量浓度，羟自由基清除率变化无显著性差异。说明前期醇提物质量浓度对羟自由基清除率影响呈现剂量依赖性。

2.3.3 脱胶葵花盘醇提物质量浓度对ABTS自由基清除率的影响

ABTS在氧化剂的作用下会形成蓝绿色的单阳离子自由基[15]，当有抗氧化剂存在时，该自由基的形成会受到抑制，颜色变浅，吸光值减小[16]。脱胶葵花盘醇提物的ABTS自由基清除率如图8所示。

图8 脱胶葵花盘醇提物的ABTS自由基清除率

由图8可知，脱胶葵花盘醇提物具有一定的ABTS自由基清除活力，但相比VC较低。当脱胶葵花盘醇提物质量浓度为0.8 mg/mL时，其ABTS自由基清除率为28.95%，随着质量浓度的增大，脱胶葵花盘醇提物的ABTS自由基清除能力增加，当脱胶葵花盘醇提物质量浓度达到1.6 mg/mL时，其ABTS自由基清除率为49.92%，呈剂量依赖性。

3 结 论

通过单因素实验和正交实验得到脱胶葵花盘醇溶物的最佳提取工艺条件为：料液比1∶ 17，超声波处理时间30 min，乙醇体积分数70%，浸提温度60℃，浸提时间1.0 h。在最佳工艺条件下，脱胶葵花盘醇提物得率达到20.32%，DPPH自由基清除率达到72.13%。脱胶葵花盘醇提物对DPPH自由基、羟自由基、ABTS自由基均具有一定的清除能力。脱胶葵花盘醇提物随质量浓度的增大，DPPH自由基清除率越接近VC，羟自由基清除率及ABTS自由基清除率低于VC，不同自由基清除率与醇提物质量浓度均呈现一定剂量依赖性。以上结果表明脱胶葵花盘醇提物具有较好的抗氧化活性。