基于调酸实现的大豆油体富集物的分离研究

居巧苓，张彩猛，孔祥珍，华欲飞，陈业明

(江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122)

油体是大豆等油料种子细胞中的贮油细胞器，是一种天然乳化的球形油滴粒子，其内部为甘油三酯，表面是一层蛋白-磷脂膜[1]。对于大豆油体，其天然状态时含有约92%甘油三酯、5%蛋白质和3%磷脂[2]。另外，大豆油体中还含有维生素E和甾醇等油溶性成分[2]。因此，大豆油体可作为一种新型的油脂产品[3]。日本不二制油株式会社在2013年基于“ultra soy separation(USS)”专利技术推出了大豆奶油(soymilk cream；实际上是大豆油体富集物的乳状液)系列产品[4]，如色拉酱、打发奶油和涂抹奶油等，经济附加值是传统豆制品的数倍。国内还没有大豆油体富集物的相关产品，目前还处在实验室研究阶段，如对大豆水相提取物进行高速离心得到上浮轻相(大豆油体富集物)[5]，或在大豆水相提取物中加入复合酶(如纤维素酶和果胶酶)、高浓度盐和蔗糖等，酶解一段时间后，再在比较低的离心力下离心得到上浮轻相[6]。

大豆经过浸泡和磨浆后，细胞微结构被破坏，其中的油体、蛋白质和碳水化合物等释放进入液相，通过除渣，即得含有上述成分的生豆浆[7]。一般而言，豆浆中的蛋白质含量是脂质含量的2倍左右。蛋白质成分包括球蛋白(glycinin，11S)、伴球蛋白(β-conglycinin，7S)、清蛋白(脂肪氧合酶(LOX)、β-淀粉酶、Kunitz型胰蛋白酶抑制剂(KTI)、Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制剂(BBI))及一些小肽和游离氨基酸[8]。豆浆的脂质成分主要来源于油体，还有少部分是在磨浆过程中吸附在球蛋白和伴球蛋白等分子表面的极性脂质[9]。研究表明，油体表面由油体膜蛋白(包括油体蛋白、油体钙蛋白和油体固醇蛋白)和磷脂等极性脂覆盖[10]。大豆油体与其他油料种子的油体相比，粒径较小(平均直径为400 nm)[11]。因此，在工业化生产的情况下，只有通过具有较大离心力的碟式离心机才能将其作为轻相有效分离，这给大规模生产带来了高要求。

“USS”即是利用上述原理的技术，对生豆浆进行一定处理后，通过碟式离心机将油体作为轻相分离出来，即为大豆油体富集物，重相部分为含有少量油体的低脂大豆蛋白液。需要说明的是：“USS”技术所得的大豆油体富集物含有一定量的大豆蛋白，约为脂肪量的一半。这是因为生豆浆中的油体表面会吸附一些大豆蛋白，这些蛋白在离心过程中随油体一起进入轻相被分离出来。

基于大豆油体在加工过程中与蛋白质的相互作用[12]，本文拟通过增加油体表面蛋白吸附量来使油体通过离心沉淀(该沉淀即为大豆油体富集物，蛋白质含量比“USS”技术高)，以此降低对离心设备的高要求，也可避开“USS”专利的技术壁垒。该方法主要基于大豆球蛋白、油体和大豆伴球蛋白的不同带电性(球蛋白pI 6.4[13]，油体pI 5.7[14]，伴球蛋白pI 4.8[13])。在一定的酸性pH下，油体与蛋白质发生聚集形成粒径较大的聚集体(油体-蛋白质聚集体)，可被低离心力离心沉淀，从而实现与其余未聚集蛋白的分离。此方法操作较为简单，对设备要求不高，豆制品或大豆蛋白加工厂通过简单的设备改造即可实现生产，对我国大豆产业的发展具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与试剂

大豆，九三牌；盐酸，国药化学试剂有限公司；丙烯酰胺、N，N′-甲叉双丙烯酰胺、溴酚蓝、巯基乙醇、三羧基氨基甲烷、甘氨酸、四甲基乙二胺和考马斯亮蓝G250，美国Sigma公司；标准蛋白，美国Bio-Rad公司。

1.1.2 仪器与设备

MJ-60BE01B打浆机，美的电器有限公司；PHS-3C型pH计，上海精密科学仪器有限公司；HimacCR-21G型离心机，日本Hitachi公司；KDN-08型消化炉；海能K9840自动凯氏定氮仪；BE-210G电泳仪，日本Bio-Craft株式会社；Agilent 1100型全自动氨基酸分析仪，美国Agilent公司。

1.2 试验方法

1.2.1 生豆浆的制备

大豆用去离子水清洗3遍后，4℃浸泡18 h，用去离子水清洗2遍，按照豆水质量比1∶9打浆2 min。200目尼龙纱布过滤，得生豆浆。

1.2.2 大豆油体富集物的分离

用2 mol/L HCl调节生豆浆的pH至6.1、6.0、5.9、5.8、5.7、5.6、5.5、5.4，搅拌10 min，5 000g(离心力可以更小，本研究为了方便样品的收集，选择了较大的离心条件)下离心45 min，得到两相——上层液相和下层沉淀，分别收集。下层沉淀即为大豆油体富集物。

1.2.3 基本成分测定

固形物含量，烘箱烘干法(105℃，3 h)；蛋白质含量，凯氏定氮法；脂肪含量，碱水解法(GB 5413.3—2010)。

1.2.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析蛋白质相对分子质量

参考Laemmli[15]的方法，浓缩胶质量分数5%，分离胶质量分数12.5%。样品溶解液为0.25 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 6.8)、1%SDS、2%巯基乙醇(非还原电泳不添加)和0.02%溴酚蓝。将样品的蛋白质含量调节至2 mg/mL，与等体积的样品溶解液混合均匀，在沸水浴中加热5 min。每个样品用微量进样针加10 μL，在浓缩胶中的电流为15 mA，样品进入分离胶后将电流调为25 mA，直至电泳结束。所得胶用凝胶成像仪拍照分析。

1.2.5 氨基酸分析

将样品加入水解管，再加入12 mol/L HCl，在110℃下水解22 h。具体操作按照氨基酸分析说明书步骤进行。

2 结果与分析

2.1 酸性pH对生豆浆固形物、脂肪和蛋白质沉降的影响(见图1)

图1a显示：pH 6.1时，沉淀质量约占生豆浆质量的9%；随pH降低，沉淀的质量分数逐渐增大；pH 5.7之后，沉淀的质量分数趋于恒定(约12%)。图1b显示：pH 6.1时，约32%的固形物分布在沉淀中；随pH降低，沉淀中分布的固形物越来越多；pH 5.4时，约有62%的固形物分布在沉淀中。图1c显示：pH 6.1时，约34%的蛋白质分布在沉淀中；随pH降低，沉淀中分布的蛋白质越来越多；pH 5.4时，沉淀中分布的蛋白质约为总蛋白质的74%。图1d显示：pH 6.1时，约60%的脂肪分布在沉淀中；随pH降低，沉淀中分布的脂肪越来越多；pH 5.4时，约98%的脂肪分布在沉淀中。

2.2 酸性pH对生豆浆离心后的液相和沉淀组成的影响(见图2)

图2 酸性pH对生豆浆离心后的液相和沉淀组成的影响

图2a显示：pH 6.1时，沉淀的固形物含量约为20%；随pH降低，固形物含量越来越高；pH 5.4时，固形物含量约为28%。该结果说明，pH降低会导致蛋白质与水之间的相互作用越来越弱。图2b显示：pH 6.1～5.9时，沉淀中脂肪/蛋白质比值接近于1；pH 5.8之后，脂肪/蛋白质比值越来越低；脂肪/固形物比值的变化趋势与脂肪/蛋白质比值类似，pH 6.1～5.9时，脂肪/固形物比值接近于0.46，之后慢慢减小。从大豆油体富集物的得率和油体富集度的角度考虑，应选择pH 5.9进行大豆油体富集物的分离制备。在得到大豆油体富集物的同时，还可得到液相部分，液相部分可作为一种低脂大豆蛋白饮品。图2c显示：pH 6.1时，液相中的脂肪是蛋白质的1/3；pH 5.9～5.8时，脂肪约是蛋白质的1/5；随pH继续降低，脂肪/蛋白质比值越来越低。

本研究所使用生豆浆的固形物含量为5.6%，蛋白质含量为2.5%，脂肪含量为1.4%。以pH 5.9条件为例，100 g生豆浆可得10 g大豆油体富集物，其固形物含量约为22%，脂肪含量约为10%，蛋白质含量约为10%；100 g生豆浆可得到90 g液相，固形物含量约为3.7%，蛋白质含量约为1.6%，脂肪含量约为0.4%。鉴于本方法的原理，所得大豆油体富集物中的脂肪含量低于“USS”技术(约13%)，而蛋白质含量要高于“USS”技术(约5.5%)。本方法所得大豆油体富集物外观与奶油极为相似，由于较高的蛋白质含量，具有较好的凝胶性和乳化性等功能性质，可加工成布丁等甜品和色拉酱等；所得液相部分可作为一种低脂大豆蛋白饮品，风味清新、口感清爽。

2.3 油体在液相和沉淀分布情况分析

本研究是基于如下原理进行的：通过调节生豆浆的pH，使得大豆油体与蛋白质发生聚集，形成尺寸较大的大豆油体-蛋白质聚集体；如果聚集体的密度大于生豆浆密度，那么离心可将聚集体沉淀；如果密度小于或等于生豆浆密度，那么离心则不会使聚集体沉淀。为了验证上述原理，设计了如下试验：将生豆浆的pH调至6.4、6.2、6.0、5.8、5.6、5.4，超速离心(197 000g，30 min)得到如下分离情况(见图3)。

注：箭头所指部分为吸附较少蛋白质的油体

图3显示：pH 5.4～5.6条件下，生豆浆分成了液相和沉淀部分；pH 5.8～6.4条件下，分成了上浮、液相和沉淀部分。该结果说明，pH 5.8～6.4条件下，油体与蛋白质的相互作用并不是均匀的，有的油体结合相对较多的蛋白质(蛋白质/油体比值大)，有的油体结合相对较少的蛋白质(蛋白质/油体比值小)，使得油体-蛋白质聚集体的密度不尽相同，从而使得有的油体-蛋白质聚集体沉淀，有的上浮；pH 5.4～5.6条件下，与油体相互作用的蛋白质量足够多，从而使得油体几乎全部沉淀。

2.4 酸性pH对生豆浆各蛋白质成分沉降的影响

对不同pH条件下的液相部分进行还原和非还原SDS-PAGE分析，结果分别见图4a和图4b。

注：M为Marker；LOX为脂肪氧合酶；KTI为Kunitz型胰蛋白酶抑制剂；α′、α和β为β-伴球蛋白(7S)的3个亚基；AB为大豆球蛋白(11S)的亚基；A和A3为11S的酸性肽链；B为11S的碱性肽链。

图4 不同pH条件下液相部分还原与非还原SDS-PAGE图谱

图4a和图4b显示：随pH降低，11S逐渐减少；pH 小于等于5.6的条件下，11S基本沉降进入沉淀。利用Image Lab 3.0软件(Bio-Rad公司)分析各条带的强度比例，再结合液相的蛋白质含量，可计算得到各蛋白成分(7S，11S和其他蛋白)在100 g生豆浆所得液相中的质量，结果见图5。

图5显示：100 g生豆浆含有2.5 g蛋白质，其中0.70 g的7S，0.85 g的11S和0.95 g的其他蛋白；随pH降低，11S快速减少，7S和其他蛋白缓慢减少；pH 6.1时，液相含有0.53 g的7S，0.47 g的11S和0.65 g的其他蛋白；pH 5.9时，液相含有0.48 g的7S，0.37 g的11S和0.58 g的其他蛋白；pH 5.5时，液相含有0.31 g的7S和0.42 g的其他蛋白，不含11S。

图5 酸性pH对生豆浆液相部分各蛋白质成分的影响

2.5 酸性pH对液相中氨基酸组成的影响(见表1)

表1显示，液相中谷氨酸和谷氨酰胺含量随pH下降而降低，天冬氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸和酪氨酸等显示出缓慢上升的趋势。

表1 不同pH条件下生豆浆离心所得液相的氨基酸组成及含量 %

3 结 论

将生豆浆调至酸性pH后，通过离心将生豆浆分成大豆油体富集物和低脂大豆蛋白液两部分。随着pH降低，越来越多的脂质和蛋白质进入沉淀，液相中11S/7S比值越来越小，在pH 5.5时，11S几乎全部进入沉淀；液相中的谷氨酸和谷氨酰胺的相对含量越来越小，其余氨基酸相对含量与原始豆浆相差不大。在综合考虑大豆油体富集物的脂质含量和低脂大豆蛋白液的蛋白质含量的情况下，本研究认为pH 5.9是较适的分离条件。在该条件下，可从100 g生豆浆分离得到10 g大豆油体富集物，其固形物含量约为22%，脂肪和蛋白质含量都约为10%；相应地，100 g生豆浆可分离得到90 g低脂大豆蛋白液，固形物、蛋白质和脂肪含量分别为3.7%、1.6%和0.4%(本研究的原始生豆浆的固形物、蛋白质和脂肪含量分别为5.6%、2.5%和1.4%)。