葡萄糖糖基化改性玉米醇溶蛋白膜的物化性质及在胶囊壳中的应用

郭 浩，张慧君,2，陈又铭，李 萍，王一正，沙迪昕

(1.齐齐哈尔大学 食品与生物工程学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006； 2.黑龙江省果蔬杂粮饮品工程技术研究中心，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

玉米黄粉(Corn gluten meal，CGM)是玉米湿法生产淀粉的副产物，其蛋白质含量在55%～65%，其中玉米醇溶蛋白占总蛋白的60%以上[1]。由于玉米醇溶蛋白的特殊氨基酸组成，使其具有良好的成膜性。有研究者将玉米醇溶蛋白膜对南国梨[2]、柑橘[3]、榛子仁[4]等的保鲜作用进行了研究，结果表明，玉米醇溶蛋白膜具有很好的保鲜作用。另外，玉米醇溶蛋白膜在酸性条件下不溶解，而在碱性或中性条件下溶解，具有肠溶性，故可将其制备成胶囊壳应用于医药领域中。

由于玉米醇溶蛋白膜的脆性大，机械性能较差，限制了其在食品、医药等领域的应用。目前，对玉米醇溶蛋白改性使其满足生产加工的需要已逐渐成为一种趋势。常见的改性方法有物理改性、化学改性、酶法改性和基因工程改性[5]。糖基化改性作为化学改性的一种，因其安全、无残留等优点被广泛应用于食品中[6-7]。张慧君等[8]在前期研究中采用麦芽糖浆改性玉米醇溶蛋白，并将改性产物制备成膜考察其机械性能，结果表明，改性后蛋白膜的抗拉强度约为改性前的2倍。

与麦芽糖浆相比，本研究采用还原性单糖——葡萄糖作为糖基化反应羰基的供体。因为葡萄糖分子结构简单，糖基化反应过程中，生成的产物物化性质较好，同时葡萄糖的价格低廉，易得，又是生物的主要供能物质，在糖果制造业和医药领域均有广泛应用。故本研究采用葡萄糖对玉米醇溶蛋白进行糖基化改性，探讨改性成膜的最佳工艺，并对改性膜进行物化性质的测定，以期为进一步制备肠溶胶囊壳并扩大应用范围提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

玉米黄粉，黑龙江省镜泊湖农业开发股份有限公司；α-淀粉酶(70 000 U/mL)，北京奥博星生物技术有限公司；无水葡萄糖、高碘酸、邻苯二甲醛、β-巯基乙醇，分析纯。

ETT-A 万能材料试验机，济南普创机电有限公司；Q-20DSC差示扫描量热仪，美国TA公司；FT-IR/NIR傅里叶变换红外光谱分析仪，美国Perkin Elmer公司；s-3400扫描电子显微镜，日本日立；WSL-1000D超声波信号发生器；LYOQUEST-85真空冷冻干燥机，西班牙泰士达；GBCY01数显膜测厚仪，浙江盛泰芯电子科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 玉米醇溶蛋白的制备

取50 g玉米黄粉，于95℃下加入0.5 mLα-淀粉酶除去淀粉，待碘试无蓝色出现即可，烘干后粉碎，以料液比1∶10加入丙酮，在50℃下脱色至黄色逐渐消失，用70%乙醇溶液浸提2 h后得到上清液，用冰水浸提后得到沉淀，冷冻干燥，得到玉米醇溶蛋白样品。

1.2.2 糖基化改性

称取玉米醇溶蛋白，按料液比1∶10加入70%乙醇溶液溶解，调节体系pH为7，加入一定质量的5%葡萄糖溶液，在60℃的磁力搅拌下糖基化反应一段时间，超声5 min后透析，得到改性产物玉米醇溶蛋白-葡萄糖。

1.2.3 蛋白膜的制备

分别将改性前后的玉米醇溶蛋白溶胶后倒入模具，于60℃烘箱烘干成膜。将烘干后的膜于温度30℃、相对湿度43%干燥器内平衡24 h。

1.2.4 蛋白膜抗拉强度的测定

将膜剪成15 mm×85 mm的矩形长条，置于万能材料试验机上固定，夹距设定为45 mm，拉伸速度为100 mm/min。按下式计算抗拉强度。

式中：TS为抗拉强度，MPa；F为最大拉力，N；L为膜样品的厚度，mm(采用数显测厚仪对样品膜的4个边缘处和中心处分别重复测定3次，求平均值为该膜厚度)；W为膜样品的宽度，mm。

1.2.5 接枝度的测定

采用邻苯二甲醛法[9]测定接枝度。

1.2.6 蛋白膜红外光谱扫描

采用FT-IR/NIR傅里叶变换红外光谱分析仪测试，扫描范围520～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1，扫描次数32次，对玉米醇溶蛋白膜和玉米醇溶蛋白-葡萄糖膜进行扫描。

1.2.7 蛋白膜微观结构测定

将玉米醇溶蛋白膜和玉米醇溶蛋白-葡萄糖膜剪成0.5 mm2的小片，将样品放入于扫描电镜样品座中，进行真空镀金处理，加速电压为15 kV，对样品表面结构进行观察拍照。

1.2.8 蛋白膜热力学性质测定

准确称取一定质量的玉米醇溶蛋白膜和玉米醇溶蛋白-葡萄糖膜样品，分别放入2个铝制坩埚中，用压盖机压盖密封。利用差示扫描量热仪以10℃/min 的升温速度从25℃加热至250℃。以样品坩埚相同的空坩埚为对照，测定玉米醇溶蛋白膜和玉米醇溶蛋白-葡萄糖膜的热力学性质。

1.2.9 胶囊壳的制备

将制备的玉米醇溶蛋白-葡萄糖抽真空脱气，备用。将涂有油的1#胶囊壳模具在70℃烘箱预热后蘸胶，每2 min一次，共15次，最后干燥5 min后拔壳。

1.2.10 数据处理

实验数据均平行测定3 次。图像处理采用Excel软件，数据统计分析采用SPSS 19.0软件，并进行Duncan多重比较。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 葡萄糖与玉米醇溶蛋白质量比对玉米醇溶蛋白改性成膜的影响

在超声功率300 W、反应时间15 min的条件下，研究葡萄糖与玉米醇溶蛋白质量比对玉米醇溶蛋白改性成膜后抗拉强度及接枝度的影响，结果如图1所示。

图1 葡萄糖与玉米醇溶蛋白质量比对膜抗拉强度和接枝度的影响

从图1可以看出，随着葡萄糖与玉米醇溶蛋白质量比的增加，接枝度和抗拉强度均呈现先增大后减小的趋势。当葡萄糖与玉米醇溶蛋白质量比为1∶10时，接枝度和抗拉强度均达到最高。这是由于在糖基化反应过程中，蛋白质分子链上的氨基与还原糖的醛基接合，逐渐形成了更加稳固的网络结构[10]。当葡萄糖与玉米醇溶蛋白质量比过大，溶液中蛋白质与糖分子的接触碰撞概率减少，降低葡萄糖与蛋白质的接枝度，从而使膜的机械性能降低。

2.1.2 超声功率对玉米醇溶蛋白改性成膜的影响

在葡萄糖与玉米醇溶蛋白质量比1∶10、反应时间15 min的条件下，研究超声功率对玉米醇溶蛋白改性成膜后抗拉强度及接枝度的影响，结果如图2所示。从图2可以看出，随超声功率增大，糖基化反应的接枝度逐渐增大后趋于平稳，蛋白膜的抗拉强度在500 W时达到最大值，随后增大超声功率，其抗拉强度降低，这是因为超声处理会促使蛋白质的分子结构伸展，提高蛋白的活性，促使蛋白质的氨基与还原糖的醛基结合，从而加快糖基化反应[11]。而过度超声会导致伸展的蛋白质分子又开始重新相互连接、聚集在一起，接枝度降低，从而导致玉米醇溶蛋白-葡萄糖膜的抗拉强度减小。

图2 超声功率对膜抗拉强度和接枝度的影响

2.1.3 反应时间对玉米醇溶蛋白改性成膜的影响

在葡萄糖与玉米醇溶蛋白质量比1∶10、超声功率500 W的条件下，研究反应时间对玉米醇溶蛋白改性成膜后抗拉强度及接枝度的影响，结果如图3所示。

图3 反应时间对膜抗拉强度和接枝度的影响

糖基化反应的实质是美拉德反应的前两个阶段，通过冷却降温控制反应的进行，因此糖基化反应的时间不宜过长，以防止美拉德反应的最终阶段生成类黑素等有毒物质[12]。从图3可以看出，当反应时间达到30 min时，蛋白膜的抗拉强度和接枝度达到最大值，继续延长反应时间，抗拉强度下降，而接枝度趋于稳定，这是由于蛋白质与葡萄糖在较短时间的磁力搅拌作用下分子间相互作用位点增多，蛋白质上接枝的糖分子较多，导致接枝度增大，分子间作用力增强使得抗拉强度增加。但进一步延长反应时间，持续的搅拌容易打断部分已形成的玉米醇溶蛋白-葡萄糖交联结构，从而使得抗拉强度降低[13]。

2.2 正交实验

在单因素实验的基础上，以葡萄糖与玉米醇溶蛋白质量比(A)、超声功率(B)、反应时间(C)为因素，以抗拉强度为指标，采用正交实验进一步优化葡萄糖糖基化改性玉米醇溶蛋白成膜的工艺条件。正交实验因素水平见表1，正交实验设计及结果见表2。

表1 正交实验因素水平

表2 正交实验设计及结果

从表2可以看出，各因素对葡萄糖糖基化改性玉米醇溶蛋白的影响程度依次是葡萄糖与玉米醇溶蛋白质量比>超声功率>反应时间，其中，葡萄糖与玉米醇溶蛋白质量比对改性产物制备成膜的抗拉强度的影响最大。葡萄糖糖基化改性玉米醇溶蛋白最佳成膜条件组合为A2B2C2，即葡萄糖与玉米醇溶蛋白质量比1∶10、超声功率450 W、反应时间30 min，在此条件下制得玉米醇溶蛋白-葡萄糖膜的抗拉强度为34.06 MPa，此时接枝度为63.05%。而前期制备的玉米醇溶蛋白-麦芽糖浆膜的抗拉强度仅达到9.22 MPa，接枝度为34.96%，进一步说明葡萄糖较麦芽糖浆更易与玉米醇溶蛋白接枝，接枝产物的机械性能更优[8]。

2.3 红外光谱

将制备的玉米醇溶蛋白-葡萄糖膜与玉米醇溶蛋白膜进行傅里叶红外光谱比较分析，结果如图4所示。

图4 玉米醇溶蛋白膜和玉米醇溶蛋白-葡萄糖膜的FT-IR谱图

蛋白质与糖分子共价结合后，一个典型的特征就是蛋白质分子中的羟基增加[14]。从图4可以看出，与玉米醇溶蛋白膜相比，玉米醇溶蛋白-葡萄糖膜在3 700～3 200 cm-1范围的—OH伸缩振动吸收峰和1 100～1 000 cm-1范围的C—O伸缩振动吸收峰均变宽，说明糖基化反应后羟基明显增多，且以共价键的方式与糖类结合，该结果与文献[15]一致。在1 690～1 630 cm-1(酰胺Ⅰ带—NH弯曲振动)、1 530～1 560 cm-1(酰胺Ⅱ带—NH弯曲振动)和1 240～1 450 cm-1(酰胺Ⅲ带C—N弯曲振动和N—H弯曲振动)范围内，振动吸收峰均有少许蓝移，这是由于糖基化改性后蛋白质的α-螺旋部分转变为β-折叠，使糖基化改性产物结构更加稳定[16]。

2.4 SEM观察

分别将玉米醇溶蛋白膜和玉米醇溶蛋白-葡萄糖膜表面放大2 000、10 000倍进行微观扫描，结果如图5所示。

注：a、b分别为玉米醇溶蛋白膜放大2 000、10 000倍；a′、b′分别为玉米醇溶蛋白-葡萄糖膜放大2 000、10 000倍。

图5 玉米醇溶蛋白膜和玉米醇溶蛋白-葡萄糖膜表面的SEM图

从图5可以看出：蛋白膜表面均无空洞，玉米醇溶蛋白膜表面有许多凹陷与凸起，平整度较差，这可能是导致玉米醇溶蛋白膜的机械性能差的主要原因；而经糖基化改性后的蛋白膜放大10 000倍，可以清楚地看到膜表面比较平整，且无褶皱，凹陷程度较轻。这可能是由于糖基化改性过程中，部分还原糖的羟基与蛋白质的氨基发生了共价结合，形成了更加稳定的糖蛋白结构，填充了玉米醇溶蛋白分子中凹陷，使蛋白膜表面更加平整。

2.5 热力学性质

实验对玉米醇溶蛋白膜与玉米醇溶蛋白-葡萄糖膜进行热力学性质的测定，结果如图6所示(向上吸热)。

图6 玉米醇溶蛋白膜和玉米醇溶蛋白-葡萄糖膜的DSC图

从图6可以看出，玉米醇溶蛋白膜的热变性温度为157.95℃，经葡萄糖糖基化改性后，交联产物膜的热变性温度升高到164.26℃。说明在糖基化反应的过程中，玉米醇溶蛋白的空间结构发生了一定的变化，逐渐形成糖蛋白结构，从而导致热变性温度发生变化，进一步说明糖基化反应可以提高玉米醇溶蛋白膜的热稳定性，该结果与文献[14]一致。从图6可以看出，糖基化反应后蛋白膜的焓变明显降低，说明糖基化过程会使蛋白质与糖分子共价结合，从而引入了大量的亲水性羟基，使改性蛋白膜表面亲水性增强[20]。

2.6 胶囊壳的基本指标

将玉米醇溶蛋白及其改性产物制备成胶囊壳，依照《中华人民共和国药典》(2015版)对胶囊壳的外观、松紧度、脆碎度、干燥失重、灼烧残渣指标进行考察，结果如表3所示。

从表3可以看出，通过玉米醇溶蛋白制备的胶囊壳材质较脆，表面有裂纹，完整度不高，而本研究采用糖基化的方式提高了胶囊壳的机械性能，经过糖基化改性的玉米醇溶蛋白-葡萄糖胶囊壳表面光滑，无气泡，韧性较好，无裂纹，完整度较好，符合《中华人民共和国药典》(2015版)的要求。

表3 2种胶囊壳的基本指标

3 结 论

本研究以玉米醇溶蛋白和葡萄糖为原料，在单因素实验基础上，采用正交实验优化糖基化改性的条件，获得最佳糖基化反应条件为葡萄糖与玉米醇溶蛋白质量比1∶10、超声功率450 W、反应时间30 min，此时制得玉米醇溶蛋白-葡萄糖膜的抗拉强度为34.06 MPa，接枝度为63.05%。红外光谱扫描证明糖分子与蛋白质结合，有效地发生了糖基化反应；扫描电镜观察发现，糖基化反应中糖分子会将玉米醇溶蛋白膜的孔洞填充，从而提高蛋白膜的机械性能；DSC测定结果表明，糖基化反应可以有效提高膜的热稳定性。经葡萄糖糖基化改性后的玉米醇溶蛋白胶囊壳符合《中华人民共和国药典》(2015版)标准。因此，天然植物蛋白制备肠溶胶囊壳作为一种新型的加工技术有极大的发展前景。本研究后期将模拟人工肠胃液，对胶囊壳的肠溶性进行检测，进一步为植物蛋白胶囊壳替代传统明胶胶囊壳提供了依据。