流通过程对大目金枪鱼肉色稳定性与氧化性能的影响

肖 蕾 蓝蔚青 孙晓红 石炳招 谢 晶

（上海海洋大学食品学院 上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心食品科学与工程国家级实验教学示范中心（上海海洋大学） 上海 201306）

金枪鱼（Tuna）为硬骨鱼纲、鲈形目、鲭科、大洋性高洄游鱼类，其生活在海洋中上层水域，主要分布于太平洋、大西洋和印度洋的热带、亚热带和温带水域，在我国东海、南海也有分布。金枪鱼味道鲜美，肉质细腻，体内富含人体大脑正常活动所必需的营养素——二十碳五烯酸（Eicosapntemacnioc acid，EPA）与二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA）等多不饱和脂肪酸，其被视作营养健康的重要鱼种，为日本、欧美等发达国家所青睐[1]。近年来，随着我国经济的发展和饮食文化的不断繁荣，金枪鱼在我国的消费量逐年增长。然而，由于其为远洋运输高值鱼类，需要采取低温流通以实现市场供应需求。流通过程中的温度与时间变化均会对其品质产生影响，导致肉色褐变[2]。其中，色泽是消费者判断其新鲜程度和货架期的重要指标，相比于其它感官品质，能直观反映金枪鱼肉的品质，从而影响消费者的购买欲望。金枪鱼肉色主要是由脱氧肌红蛋白（Deoxymyoglobin，DMb）、氧合肌红蛋白（Oxymyoglobin，OMb）与高铁肌红蛋白（Metmyoglobin，MMb）等3种肌红蛋白的含量分布所决定，其在一定条件下可相互转化，导致肉呈暗紫、暗红与褐色[3]。这3种不同氧化状态的肌红蛋白通过氧化还原反应相互转变，其相对含量决定了金枪鱼肉色的深浅，现有研究认为肌红蛋白的氧化是导致鱼肉色泽劣变的直接原因[4-5]。

影响金枪鱼色泽的指标主要有脂肪氧化能力、肌红蛋白氧合状态、高铁肌红蛋白酶活力等。而反映肌肉抗氧化能力的指标主要有总酚浓度、铁离子抗氧化还原能力与自由基清除能力等[6]。近年来，国内外部分研究学者针对金枪鱼色泽与酶活力等方面开展了相关研究。其中，Chiou等[7]比较了4℃冷藏和-20℃冻藏60 d时金枪鱼肌肉MMb还原能力的变化，发现其分别降低了25%和33%，结果得出高铁肌红蛋白还原酶活力有利于肉色稳定性。王玮等[8]研究显示肉色不仅取决于Mb的氧化状态，同时还与肌红蛋白含量正相关。Pong等[9]研究发现，金枪鱼肉在低于15℃条件下贮藏时，对MMb还原能力的影响最小，而高于30℃时，MMb还原能力显著降低。脂质氧化是金枪鱼宰后流通过程中影响鱼肉品质的主要因素之一，这一反应加速了肉色劣变[10]。通过提升抗氧化能力来改善肉色稳定性成为现今主要研究热点[11]。本文通过分析金枪鱼在3种流通条件下的抗氧化能力变化规律与肉色稳定性的关系，并对其进行相关性比较与动力学分析，以期找到肌红蛋白与肉色稳定性间的关系，为保持金枪鱼肉色稳定性与延缓品质劣变提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验原料

大目金枪鱼（由浙江丰汇远洋渔业有限公司于2016年6月捕捞于太平洋近海，经船上屠宰冷冻后直接抽真空冻藏于-55℃），上海海洋大学海洋科学学院。

1.2 主要试剂

Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、HCl、FeCl3、K4Fe（CN）6、K3Fe（CN）6、EDTA、NADH、福 林 酚 试剂、单宁酸、邻菲罗啉、透析袋，国药集团化学试剂有限公司；NaCl，上海埃彼化学试剂有限公司；CuSO4、C4H4KNaO6·4H2O、CH3（CH2）10CH2OSO3Na、C4H11NO3、C2H5NO2，上海生工生物工程股份有限公司，均为国产分析纯级。

1.3 主要仪器与设备

SCIENTZ-ⅡD超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司；722型可见分光光度计，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；DW-86L388型立式超低温保存箱，青岛海尔特种电器有限公司；TGL-16M型台式高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；FJ200-S型数显高速均质机，杭州齐威仪器有限公司；BS210S型电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 试验设计 CK（产地直销）为-55～4℃；L1（超市直销）为-55～-18℃，再于超市2℃销售后到家庭4℃贮藏；L2（超市零售）为-55～2℃销售，-18℃贮藏再置于2℃销售，最终到达家庭4℃贮藏。试验周期为216 h，具体试验路线与时间轴安排如图1所示。

1.4.2 红度值a*将鱼肉切成20mm×15mm×10 mm的方块，选用直径10mm透镜，采用色差计反射法[12]测定样品。每个样品正反两面均进行3次测定，取平均值，用于表征鱼肉肉色变化。

1.4.4 肌红蛋白氧化态 参考Krzywicki[14]法。称取5.0 g肉样，加入25mL磷酸缓冲液（40mmol/L、pH 6.8、4℃），匀浆 25 s后冰浴静置 1 h，4℃离心（3 000×g、25 min），上清液测 525，545，565，572 nm波长下的吸光值，计算OMb和MMb的相对含量，即：

式中，R1、R2、R3——分别为572，565，545，525 nm波长处的吸光度的比值。

1.4.5 高铁肌红蛋白还原酶（MetMbase） 称取5 g鱼样，加入2.0mmol/L磷酸盐缓冲液，匀浆至浑浊，10 000 r/min离心20min，取上清液并加入K3Fe（CN）6，再用截留分子量为10 000的透析袋进行透析，透析后得到粗酶液。以EDTA和磷酸盐为缓冲液，以去离子水为空白对照，在波长580 nm处测MetMb与MbO2的吸光度，摩尔消光系数为12 000 L/mol·cm[10]。其中，一个酶活力单位为每min还原1 nmol高铁肌红蛋白的酶量。

1.4.6 抗氧化能力分析 参照Luciano等[6]的方法制备大目金枪鱼肌肉提取液。取2 g切碎后肉样，加40mL去离子水，冰浴条件下9 500 r/min匀浆30 s，后置于冰水浴中超声细胞破碎处理5min。提取液在3 500 r/min、4℃下离心15min，上清液经滤纸过滤后立即进行抗氧化能力指标测定。

1.4.6.1 总酚浓度（Total phenol concentration，TPC） 参考Wootton-Beard等[16]的方法进行总酚含量测定。将500μL肌肉提取液与500μL去离子水等量混合，加入500μL 1mol/L的Folin-Ciocalteau试剂，静置3 min后加入2.5 mL 20%Na2CO3溶液并彻底混匀，混合液避光条件下25℃水浴 1 h，于3 000 r/min、4℃离心 10min，除去沉淀。以不含肌肉提取物的Folin-Ciocalteau试剂稀释液作为空白，上清液在波长760 nm处测定吸光值。制备标准曲线，总酚含量用mg单宁酸当量（TAE）/g肌肉表示。

1.4.6.2 铁离子抗氧化还原能力（Ferric reducing antioxidant power，FRAP） FRAP表示为每克肌肉能生成的Fe2+的微摩尔当量数，具体方法参考Benzie等[18]的方法。取3mL FRAP试剂水浴至37℃，加入300μL去离子水和100μL肌肉提取液，37℃水浴孵化4min，在波长593 nm处测定吸光值，用已知浓度范围的FeSO4做标准曲线，计算溶液中Fe2+的浓度。

1.4.7 氧化能力变化规律的相关性分析 通过SPSS13.0软件中的Pearson进行相关性分析。

在信息化会计教学过程中，教学的目标和内容选择十分关键。因为只有选择合适的教学目标和内容才能有利于会计信息化的学科建设，有利于提高信息化会计教学的质量，有利于培养出适应社会需要的应用型会计人才。下面将从信息化会计教学的理论内容和实践教学内容进行探讨。

1.4.8 氧化能力变化规律的动力学分析 将TPC、FPAR等氧化能力指标与色泽稳定性指标在流通期间的变化规律进行动力学方程拟合，通过动力学模型参数分析其氧化能力的变化规律。

1.5 数据处理

试验数据均采用3次平行试验的平均值，数据用软件Origin（Pro）8.5绘制曲线，数据间的差异通过统计软件SPSS13.0中的Duncan新复极差法进行方差分析与多重比较，结果以平均值±标准偏差表示。

2 结果与分析

2.1 流通过程中大目金枪鱼的a＊ 值变化

大目金枪鱼的色泽变化与高铁肌红蛋白含量密切相关。新鲜样品的初始肌肉呈鲜红色，其主要含有Fe2+肌红蛋白，a*值相对较高；随着流通时间及温度波动的影响，样品中的肌红蛋白易被氧化成高铁肌红蛋白，颜色逐渐变暗，a*值相应降低，鱼肉呈红褐色[19]。因此，红度值是评价金枪鱼感官品质的重要指标。

图2 流通过程中大目金枪鱼红度值的变化Fig.2 The change of a* of big-eye tuna in different logistic processes

由图2可知，金枪鱼样品的初始a*值均为10.89，此时鱼肉呈鲜红色。随着流通过程的延长，3组样品的a*值均不同程度下降，肌肉色泽变暗，产生褐变。随着流通时间的延长，其红度值分别降至5.53、4.64和2.43（P＜0.05），鱼肉色泽已发生不同程度的褐变。冷链组（CK）样品在整个过程中的红度值下降较平缓，断链组样品a*值的下降趋势显著，其中以L2组样品的降幅最明显。由此表明，温度波动能加剧大目金枪鱼鱼肉褐变，这与Yaowapa等[20]研究金枪鱼在酚类物质与气调结合下红度值的变化结果一致。

2.2 流通过程中大目金枪鱼的TBA值变化

TBA值是反映鱼体脂肪含量变化的重要指标，冷藏条件下，水产品的TBA值随着贮藏时间的延长而增大，这与鱼肉贮藏期间的脱水与不饱和脂肪酸氧化物含量的增加密切相关[22]。通常样品的TBA值与冻藏时间、冻藏温度呈正相关，数值越大，表明样品脂质氧化程度越严重[28]。

图3 流通过程中大目金枪鱼TBA的变化Fig.3 The change of TBA value of big-eye tuna in different logistic processes

由图3可知，3组样品的TBA值在168 h前无显著变化，204 h后冷链组样品由于经过-55～2℃的温度波动处理，其TBA值在流通中期开始上升，断链组样品在168 h后经历了2个不同阶段的变温处理，其TBA值增加明显，尤以L2组处理变温显著，则样品TBA值变化最剧烈，且在168 h（即在销售环节2℃）3组间开始出现明显差异（P＜0.05）。流通过程中，CK组、L1与 L2组样品的TBA值分别增长了 51.38%，69.85%，82.56%（P＜0.05）。由于金枪鱼肌肉中含有丰富的EPA、DHA等多不饱和脂肪酸，低温有氧流通条件下，脂质氧化不可避免，可能由于流通环境与温度波动的原因，导致断链组样品TBA值产生明显上升，从而使流通过程中鱼肉发生自动氧化或水解作用，反应产生低级醛酮类，使食品变色、酸败。该结果与Katsunori等[23]的研究结论一致。

2.3 流通过程中大目金枪鱼肌红蛋白氧化状态的变化

肌红蛋白的化学状态是影响鱼肉颜色的主因，可通过测定高铁肌红蛋白指标变化来表征金枪鱼颜色变化[23]。当铁离子为+2价，配位键结合O2时，为鲜红色的氧合肌红蛋白，是消费者喜欢的颜色；然而，+2价铁离子不稳定，易氧化为+3价，变成褐色的高铁肌红蛋白，产生不被消费者接受的颜色；当铁离子配位键不连接其它分子且为+2价时，为脱氧肌红蛋白，这种氧化状态的肌红蛋白为紫红色[24]。

图4 流通过程中大目金枪鱼肌红蛋白氧化状态的变化Fig.4 The change of OMb and MMb of big-eye tuna in different logistic processes

由图4可知，3组样品的氧合肌红蛋白相对含量（OMb%）均出现下降，在168 h前，冷链对照组样品由于始终处于-55℃的低温环境，其值基本不变。L1组样品由-55℃升至-18℃，OMb相对含量变化相对缓慢，而L2组样品先后经历了-55，-18，2℃的温度波动过程，其值变化最显著（P＜0.05）。在216 h时，3组样品的OMb相对含量分别下降了 34.46%，49.84%，68.69%（P＜0.05），此时各组样品的MMb和OMb相对含量的变化呈负相关，均显著上升。因此，随着流通时间的延长，金枪鱼鱼肉氧合肌红蛋白逐渐减少，高铁肌红蛋白逐渐累积，样品中的肌红蛋白自动氧化使鱼肉由最初的鲜红转为红褐色[25]。由此，充分说明鱼肉红度值在流通过程中的变化，这与Chotika等[26]研究得出金枪鱼鱼肉的变色程度取决于氧化肌红蛋白生成率的高低结论一致。

2.4 流通过程中大目金枪鱼高铁肌红蛋白酶活力的变化

高铁肌红蛋白还原酶是肌肉中存在可还原高铁肌红蛋白的一类酶，肉色褐变是由于氧合肌红蛋白氧化产生，而肌细胞内部的高铁肌红蛋白还原酶可起到阻抗MMb的累积，从而起到稳定肉色的作用[7]。

由图5可知，样品在流通过程中的高铁肌红蛋白还原酶始终保持活性，可将高铁肌红蛋白还原为二价的肌红蛋白，保持肉色稳定；结果表明，鱼肉在-55℃与-18℃的低温条件下，其高铁肌红蛋白活性较低。随着流通过程温度上升，在2℃与4℃时，高铁肌红蛋白活性较高，可被还原为二价肌红蛋白。由此说明高铁肌红还原酶受温度波动变化显著，对高铁肌红蛋白的还原能力产生影响，加速鱼肉的色泽改变。Ching等[27]以蓝鳍金枪鱼为研究对象，结果发现高铁肌红蛋白还原酶与肉色稳定性呈正相关，高铁肌红蛋白还原酶是维持金枪鱼肌肉鲜红色的主因。

图5 流通过程中大目金枪鱼高铁肌红蛋白酶活力的变化Fig.5 The change of metmyoglobin reductase activity of big-eye tuna in different logistic processes

2.5 流通过程中大目金枪鱼样品的TPC分析

TPC用于表征肌肉中酚类化合物的浓度，酚类化合物能清除自由基，起到抑制氧化的作用[28]。

由图6可知，TPC初始值为1.5mg TAE/g，表明其酚类物质含量相对丰富。随着流通时间的延长，3组样品除对照组在192 h内的TPC值基本保持稳定以外，其余两组样品均呈下降趋势，尤其以L2组样品变化最明显（P＜0.05）。由此说明低温环境对金枪鱼样品的氧化有较好的抑制作用，TPC含量随着流通温度的升高而显著降低，此时3组样品在流通过程中，由于2℃与4℃较高温度波动的影响，使其TPC值下降了35%（P＜0.05），由此可知流通过程中的温度波动对样品氧化影响较大。3组样品在流通末期（216 h）的TPC值差异不明显，表明其抗氧化作用在4℃ 24 h后均达较低水平，TPC值在经历一定流通时间与流通温度波动后，其抑制氧化效果达到较低水平，此时鱼肉开始腐败，酚类物质随之分解。

2.6 流通过程中大目金枪鱼样品的FRAP分析

FRAP值主要用于表征肌肉组织将Fe3+还原成Fe2+的能力，是衡量肌肉抗氧化还原能力的主要指标[16]。

图6 流通过程中大目金枪鱼的TPC的变化Fig.6 The change of TPC value of big-eye tuna in different logistic processes

图7 流通过程中大目金枪鱼的FRAP的变化Fig.7 The change of FRAP value of big-eye tuna in different logistic processes

由图7可知，3组样品的高铁肌红蛋白相对含量FRAP均显著下降，其中L2流通组样品变化最明显。整个流通过程中，冷链组和断链L1与L2组大目金枪鱼肉的FRAP值分别降低了16.15%，48.21%，64.78%（P＜0.05）。肌肉中 MMb是血红素辅基中Fe2+氧化为Fe3+的结果。结果表明，肌肉组织中还原Fe3+的能力随流通时间的延长逐渐降低，这与MMb累积有密切联系。由此证明脂质氧化与肌红蛋白氧化作用耦合，促进肌红蛋白氧化，而MMb中的Fe3+又会加速脂质氧化，导致肌肉发生肉色劣变和氧化酸败现象[29]。

2.7 氧化能力变化规律的相关性分析

由表1可知，对照组流通期间由于温度波动较小，各指标变化趋势显著相关。断链组除TBA值外，其余均达到0.800以上，说明高铁肌红蛋白的氧化、酶活、氧化性能均与鱼肉色泽的变化显著相关，而氧化性能与高铁肌红蛋白的相互转化、酶活相互联系。综合结果得出，TPC、FRAP等抗氧化能力指标与TBA值、肌红蛋白氧化态MMb相对含量、酶活显著相关。其中，鱼肉红度值在冷断链中的相关性除TBA值，其与均达到0.800以上，因此，鱼肉红度值的变化可作为评价品质的指标。大目金枪鱼样品在流通期间随着红度值的下降，鱼体中的脂质逐渐酸败，氧合肌红蛋白逐渐转化为高铁肌红蛋白而加速鱼肉褐变，氧化性能随之降低。

表1 大目金枪鱼流通期间各组指标的相关性分析Table1 Correlation analysis between each index of big-eye tuna in different groups during logistic processes

2.8 氧化能力变化规律的动力学分析

在贮藏过程中，食品品质随时间的变化规律可用食品品质方程来表示[30]。一般情况下，食品品质变化规律均遵循0级和1级模式。因此，试验采用食品品质函数对反映金枪鱼抗氧化能力的指标（TPC、FRAP）与 TBA值，MMb 相对含量、酶活在流通过程中的变化规律进行动力学方程拟合，通过动力学模型参数分析抗氧化能力的变化规律，结果见表2。表2列出了不同反应级数下肉色和抗氧化动力学模型的参数，其中k值为反应速率常数，其绝对值越大表明化学反应速率越大。当k＞0时，表明相应指标随时间延长而积累，当k＜0时，表明指标随时间延长而消减。回归系数R2表征动力学模型的线性拟合程度，R2越接近于1，则动力学模型的拟合度越高[31]。

表2 不同反应级数下氧化能力变化及颜色变化动力学模型的反应速率常数k和回归系数R2 Table2 Kinetics model parameters of lipid oxidation and color in different orders

由表2可以看出，在模型拟合度方面，除对照组样品中的MMb%外，不同流通过程中的抗氧化能力指标的拟合度均较好，L1断链组样品的抗氧化能力指标模型拟合度R2＞0.73，明显优于L2断链组与冷链组，说明其在流通过程中的变化更趋线性。在反应速率方面，3种流通过程金枪鱼的抗氧化能力指标（TPC，FRAP）均呈下降趋势（k＜0），TBA、MMb相对含量和酶活力上升（k＞0）。且TBA值与MMb相对含量反应速率常数k值的变化结果为冷链组均低于断链组，表明流通期间金枪鱼冷链被氧化的速率缓于断链组，由此可知温度波动越大则大目金枪鱼的抗氧化能力越不稳定，颜色变化越显著。

综上所述，肉色劣变过程伴随着脂质氧化程度升高及抗氧化能力的降低。通过氧化能力变化规律的动力学分析表明，脂质氧化与抗氧化能力、肉色稳定性密切相关，不同流通过程中，脂质氧化程度增加，则抗氧化能力降低，色泽褐变程度与温度变化、流通方式显著相关。

3 结论

肉色劣变伴随着脂质氧化程度升高，抗氧化能力降低的变化。主要表现为TBA值随着流通过程中温度波动而产生酸败，红度值逐渐上升的过程中伴随肌红蛋白相互转化，OMb相对含量降低、MMb相对含量升高，两种含量呈相对正相关。而高铁肌红还原酶又是肌红蛋白氧化反应的主导因素，酶的活性直接决定了鱼肉的红度值。

大目金枪鱼在流通过程中，TPC值和FRAP值呈显著线性降低的趋势，表明其内源抗氧化能力在流通期间逐渐减弱。同时，冷链组样品的抗氧化性能明显优于断链组，尤其L2组样品变化最为显著，说明温度波动越大对其脂质氧化程度、颜色褐变与抗氧化性能的影响越显著，故断链组在-55℃解冻流通48 h后，即在销售（2℃）环节为品质劣变关键点。对各指标之间的相关性分析发现，大目金枪鱼鱼肉的红度值变化灵敏，因此可将其作为判别鱼肉品质变化程度的参考值之一，而不能将其作为具体判别其品质变化的突变点，仍需结合其它指标予以综合分析。样品在流通过程中，随着样品红度值的下降，鱼肉脂质逐渐酸败，氧合肌红蛋白转化为高铁肌红蛋白，氧化性能随之下降。动力学分析结果表明，大目金枪鱼的脂质氧化程度、抗氧化能力及肉色相对稳定性随温度波动及流通方式的不同，呈显著相关。流通期间的温度波动越大，大目金枪鱼的抗氧化能力越不稳定，色泽变化愈明显。