硫酸寡糖锌促进小鼠生长发育及抗氧化作用

常满倩 安凤平 宋洪波 黄 群 王艺伟 滕 慧

（福建农林大学食品科学学院 福州 350002）

锌是人及动物机体的一种必需微量元素，也是儿童易缺乏的微量元素，其生物学意义直到19世纪才被注意[1-2]。缺锌会影响蛋白质和核酸的合成以及细胞的分化、增殖，从而引起生长发育障碍，造成食欲不振、厌食和异食癖，进而影响儿童的生长发育[3]。据以往研究显示，张伟淳[4]发现缺锌会改变嗅觉和味觉，导致食欲不振，体重下降；Michael[5]调查发现缺锌会引起生长迟缓；周丽玲等[6]证明缺锌可以使大鼠脂质过氧化反应明显加强，抗氧化能力下降。早期的补锌剂多为ZnSO4、ZnCl2、ZnO等无机锌，人体吸收利用率低且对消化系统有毒副作用。近年来，最常用葡萄糖酸锌作为补锌产品，而临床显示有恶心、便秘等不适症状。锌在体内发生作用是它的有机物或螯合物形式，而非游离的无机锌离子，无机锌在体内需转化为有机物形式而发挥作用[7]。有机锌生物学利用率高于无机锌，更接近于体内的作用形式，具有生物学效价高，安全及副作用小等特点[8]。目前关于硫酸寡糖锌的研究鲜有报道。

硫酸寡糖溶解性好，具有结构简化，易于吸收等优点，硫酸寡糖分子中含有大量游离的硫酸基和羟基，对金属离子有稳定的配位作用。本研究以麒麟菜为原料提取硫酸多糖，并制备硫酸寡糖锌配合物，比较硫酸寡糖锌、硫酸锌、葡萄糖酸锌促进缺锌小鼠生长发育和抗氧化作用，为开发新型补锌剂及功能食品提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原料：麒麟菜，福建漳州。

动物：SPF级昆明雄鼠，体重 25～31g，福州总医院。

饲料：缺锌饲料、对照饲料，南通特洛菲饲料科技有限公司。

试剂：100～500 u、3 000 u 透析袋，北京索莱宝公司；AKP（碱性磷酸酶）试剂盒、MDA（丙二醛）测试盒、T-AOC（总抗氧化能力）试剂盒，南京建成生物工程研究所；乙醇、硫酸、NaOH、KOH、ZnSO4·7H2O均为分析纯级，中国医药集团；葡萄糖酸锌（分析纯级），阿拉丁试剂。

1.2 仪器与设备

电子天平（BSA224S型）、数显pH计（PB-10型），赛多利斯科学仪器有限公司；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9203A型），上海精宏实验设备有限公司；旋转蒸发仪（N-1100型）、冷冻干燥机（FDU-1200型），上海爱朗仪器有限公司；数显恒温水浴锅（HH-4），国华电器有限公司；加热磁力搅拌器（RH D S25型），德国IKA公司。

1.3 试验方法

1.3.1 硫酸寡糖锌的制备 参考候丽丽[9]提取多糖的方法从麒麟菜中提取硫酸多糖，参考吴海歌等[10]水解多糖的方法进而制备硫酸寡糖。

称取1.00 g硫酸寡糖，加入0.88 g ZnSO4·7H2O，用 0.1 mol/L H2SO4调节 pH值为6.00±0.05，60℃温度磁力搅拌2 h；冷却至室温，先用100～500 u透析袋透析48 h，收集袋内溶液，再用3 000 u透析袋透析48 h，收集袋外溶液，冷冻干燥得硫酸寡糖锌。采用原子吸收法[11]测得硫酸寡糖锌的含锌量为83.8μg/mL。

1.3.2 缺锌小鼠模式的建立 20只小鼠，随机分为空白组和缺锌组2个试验组，每组10只，饲喂于动物实验室的塑料笼中，室内环境相对湿度60%±5%，温度（25±1）℃。经 3 d适应期喂养后，缺锌组饲喂缺锌饲料，空白组饲喂对照饲料（除含锌外，其它成分均与缺锌饲料相同），连续饲喂16 d，自由觅食，自由饮用去离子水。

1.3.3 硫酸寡糖锌促进小鼠生长发育及提高抗氧化能力的喂养试验 60只小鼠，随机分为空白组、缺锌组、硫酸锌组、葡萄糖酸锌组、低寡糖锌组、中寡糖锌组和高寡糖锌组等7个试验组，每组10只。经3 d适应期喂养后，除空白组饲喂对照饲料外，其它试验组均饲喂缺锌饲料，喂养环境同1.3.2节所述，连续饲喂16 d。其中，硫酸锌组、葡萄糖酸锌组分别灌喂硫酸锌、葡萄糖酸锌，剂量均为6.96mg Zn/kg bw，低、中、高剂量寡糖锌组灌喂剂量依次为1.74，3.48，6.96mg Zn/kg bw；空白组和缺锌组小鼠以等体积生理盐水替代，自由觅食，自由饮用去离子水。

图1 小鼠摄食量变化Fig.1 Food intake changes of mice

1.3.4 检测指标及方法 生长发育：每3 d记录摄食量，测体重1次；第17天宰杀全部小鼠，取其血清（来源于心脏取血）、肝脏、肾脏、脑和睾丸，称量各脏器的质量，用原子吸收分光光度计测定血清和肝脏中锌的含量；将肝脏与生理盐水按质量比1∶9制成肝匀浆，离心取上清液，采用试剂盒测定血清及肝匀浆中碱性磷酸酶（AKP）活力。

抗氧化能力：分别采用专门试剂盒测定小鼠血清及肝匀浆中的丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶活力（SOD）以及总抗氧化能力（T-AOC）。

1.4 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 小鼠缺锌模式的建立

小鼠的摄食量如图1所示，与空白组小鼠相比，缺锌组小鼠的摄食量自第4天起明显减少（P＜0.01）；小鼠体重如图2所示，2组小鼠体重均随着喂养时间的延长而增大，然而缺锌组小鼠的体重从第10天开始较大程度低于空白组小鼠（P＜0.05），至16 d体重明显低于空白组小鼠（P＜0.01）。经观察，喂养14 d后，空白组小鼠毛色、精神状态良好；缺锌组小鼠毛发微黄且粗糙，且出现互相撕咬、情绪异常亢奋等现象，表明缺锌使小鼠食欲降低，出现异食癖症状。

图2 小鼠体重变化Fig.2 Weight changes of mice

第17天处死小鼠，测得的血清和肝脏中的锌含量及AKP活力参见表1、表2。经过16 d饲喂缺锌饲料，缺锌组小鼠的血清中的锌含量仅为空白组的53%，肝脏中的锌含量为空白组的69.47%，AKP活力明显下降，缺锌组小鼠和空白组小鼠之间存在极显著差异（P＜0.01）。由此可见，缺锌模式建立成功。

2.2 提升体内锌含量

血清可以提供细胞生长所需要的营养物质，血清中的锌浓度是反应机体锌状态的标志性指标[12]。肝脏是人体重要的代谢器官，是多种微量元素吸收、贮存、代谢的场所，且锌元素与肝脏功能关系密切，故血清及肝脏中的锌含量可反映机体对锌吸收的水平。AKP是一种锌依赖酶，其活性变化能够间接反应锌的营养状况[13]。

表1 补锌对小鼠血清、肝脏中锌含量的影响Table1 Zinc content of serum and liver after zinc supplementation

表2 补锌对小鼠血清、肝脏中AKP活力的影响Table2 Activity of AKpIn serum and liver after zinc supplementation

由表1可以看出，与缺锌组相比，各补锌组小鼠血清及肝脏中锌含量均显著增大，其中硫酸锌组的血清和肝脏中锌含量在所有补锌组中最低，葡萄糖酸锌组的血清中锌含量和肝脏中锌含量分别为0.979μg/mL和23.71μg/g，均显著高于硫酸锌组，高剂量寡糖锌组小鼠血清中锌含量和肝脏中锌含量最高（分别为1.136 μg/mL，26.63 μg/g），基本达到空白组（正常小鼠）的水平。对于同一组补锌剂而言，血清中锌含量低于肝脏中的锌含量，与金月[8]研究壳寡糖对血清、肮脏中锌含量结果一致，可能与锌通过肝脏再进入心脏血液中被逐步利用有关。

表2所示血清及肝脏中AKP活力，呈现与表1中锌含量相似的变化趋势，其中高剂量寡糖锌组小鼠的AKP活力最高，基本达到与空白组的水平。血清及肝脏中AKP活力与锌含量的响应关系进一步表明，喂食各补锌剂时所测定的小鼠血清、肝脏中锌含量是可靠的。

2.3 促进摄食及生长发育

由表3可知，各组小鼠的初始摄食量和初始体重差异均不显著，说明小鼠健康，摄食与体重均处于同一水平。

喂养16 d，各补锌组小鼠的最终摄食量都显著大于缺锌组小鼠。在各补锌组中，硫酸锌组小鼠的最终摄食量最少（3.80 g），高寡糖锌组摄食量最高（4.53 g），葡萄糖酸锌组和中剂量寡糖锌组小鼠的最终摄食量相当，均显著低于高剂量寡糖锌组（P＜0.05）。

另外，与缺锌组相比，各补锌组小鼠的体重均显著增加，与最终摄食量对比分析，并不存在简单的正相关关系。虽然低剂量寡糖锌和硫酸锌增加小鼠摄食量的效果相当，但低剂量寡糖锌增加小鼠体重效果更显著，且低剂量寡糖锌（剂量为1.74mg Zn/kg bw）能达到与葡萄糖酸锌（剂量为6.96mg Zn/kg bw）相当的增加体重效果；高剂量寡糖锌（剂量为6.96mg Zn/kg bw）则较葡萄糖酸锌显著增加小鼠的体重，且与空白组小鼠的体重相当。

表3 补锌对小鼠摄食量和体重的影响Table3 Effects of zinc supplement on food intake and weight for mice

由表4可知，各补锌剂均可在不同程度上增加缺锌小鼠肝脏、肾脏和脑的质量，其中硫酸锌组仅能显著增加缺锌小鼠肾脏质量，葡萄糖酸锌组和各剂量寡糖锌组均可显著增加肝脏、肾脏和脑的质量，高剂量寡糖锌增加程度最大（分别为2.337，0.723，0.467 g），且达到与空白组相当的水平。另外，只有各剂量寡糖锌组显著增加了缺锌小鼠的睾丸重，其中，中、高剂量寡糖锌组的睾丸质量最大，且高剂量寡糖锌组达到与空白组相当的水平。因此可得出，硫酸寡糖锌促进小鼠生发育的效果好于葡萄糖酸锌和硫酸锌，高剂量硫酸寡糖锌可全面促进小鼠肝脏、肾脏、脑和睾丸等器官全面生长发育。

表4 补锌对小鼠主要脏器质量的影响Table4 Effects of zinc supplement on organ mass for mice

2.4 抗氧化作用

MDA反映机体细胞受自由基攻击的严重程度；SOD活力的高低间接反映了机体清除氧自由基的能力[14]；T-AOC为总抗氧化能力，可以反映机体防御体系抗氧化能力的强弱。

由表5可知，各锌补充剂均可显著降低缺锌小鼠肝脏中MDA含量，增加SOD活力和T-AOC能力，其中葡萄糖酸锌的效果显著优于硫酸锌，高剂量硫酸寡糖锌的效果最好、其抗氧化能力超过了空白组。表6所示各锌补充剂对缺锌小鼠肝脏中MDA含量、SOD活力和T-AOC的影响，其中硫酸锌效果不明显，葡萄糖酸锌的效果明显，高剂量硫酸寡糖锌的效果最好，其抗氧化能力亦超过了空白组。

表5 补锌对小鼠肝脏中MAD、SOD和T-AOC的影响Table5 Effects of zinc supplement on MDA，SOD and T-AOC in liver

表6 补锌对小鼠血清中MAD、SOD和T-AOC的影响Table6 Effects of zinc supplement on MDA，SOD and T-AOC in serum

3 讨论

本研究结果表明，硫酸寡糖锌可显著提高血清和肝脏中的锌含量，并且较同剂量的硫酸锌和葡萄糖酸锌效果好，一方面，因为有机态锌能防止锌在体内与植酸、草酸等结合形成难以吸收的化合物[15]，另一方面，由于不同锌源的配体分子质量不同，被机体吸收代谢途径不同所导致[16]。此外，寡糖能够提高消化器官的功能，从而促进营养物质的吸收[17]，因此机体对硫酸寡糖锌的吸收高于葡萄糖酸锌和硫酸锌。锌是AKP合成所必需的金属元素，且在一定范围内与锌含量成正比[18]，本研究结果表明，硫酸寡糖锌较硫酸锌和葡萄糖酸锌更能提高AKP活力，这与机体对硫酸寡糖锌的吸收高于葡萄糖酸锌和硫酸锌相一致。

锌也是唾液蛋白的重要成分，对口腔及味蕾的功能和代谢具有重要作用，可改善食欲，增加摄食量[19]，硫酸寡糖锌能够更显著增加缺锌小鼠摄食量、体重，与文献[8]报道壳寡糖锌的效果相似；硫酸寡糖锌能更明显地增加缺锌小鼠的肝脏、肾脏、脑及睾丸的质量，是因为锌可影响机体生长激素和生长调节素等的合成与分泌，提高机体的解毒能力、智力和性行为[8，20-21]，促进相关器官发育，从而进一步改善食欲，增加体重。有研究证实，寡糖既能提高小鼠肝脏质量[22]，也能提高机体的免疫功能，进而促进生长[23]。因此，硫酸寡糖的增效作用使得硫酸寡糖锌较硫酸锌和葡萄糖酸锌可以更好地促进生长发育。

机体通过非酶系统产生的氧自由基会攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，并因此形成脂质过氧化物，如醛基（MDA）、酮基、羟基、羰基、氢过氧基或内过氧基，以及新的氧自由基等，从而导致细胞损伤。MDA的量直接反映机体内脂质过氧化程度，间接反映出细胞损伤程度；SOD对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，它能清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受伤害；T-AOC水平直接反映机体内酶类和非酶类抗氧化物的总体水平[14]。锌是机体抗氧化体系的重要组成之一，它能防止细胞膜氧化，减少超氧阴离子形成[24]。锌缺乏时，脂肪氧化增加，可能诱发机体产生氧化损伤[25-27]。各补锌剂均可降低小鼠的MDA含量，提高SOD及T-AOC活力，这与荔霞等[28]、刘磊等[29]的研究报道一致；并且抗氧化能力变化与血清锌和肝脏锌的变化基本一致，这与锌对机体抗氧化作用的影响相吻合。有研究表明，寡糖可降低机体内MAD含量，显著提高SOD、T-AOC活性[30]，具有良好的抗氧化能力。因此，高剂量硫酸寡糖锌的抗氧化能力优于相同剂量的硫酸锌和葡萄糖酸锌的抗氧化效果，乃至超过空白组（正常小鼠）的抗氧化能力。

硫酸寡糖锌具有更好的促进缺锌小鼠生长发育和抗氧化能力，可能由于硫酸寡糖中含有大量的硫酸基和羟基，与锌配位后，使配位部分与暴露的活性基团协同作用，增强机体对锌的吸收从而促进生长发育；同时也促进了与自由基的作用，提升了其抗氧化能力[31]。