二烯丙基二硫醚对产志贺毒性大肠杆菌毒力基因表达及生物学特性的影响

李鑫鑫 杨春雪 吴虹燕 魏丽娜 侯红漫 张公亮

（大连工业大学食品学院 辽宁大连 116034）

食用香料是一类能增添食物香味和香气的食品添加剂[1]。在食用香料中，含硫香料占据非常重要的位置。由于硫的香气阈值低，特点强，体积小，可广泛应用于食品香精，特别针对肉类风味的不足，对提高风味质量起重要作用。其中硫醚的化合物是含有R-（S）n-R'结构，在可食用含硫化合物这一类中含量最多的物质[2]。二烯丙基二硫醚（Diallyl disulfide，DADS）在葱属植物中比较常见，为大蒜素中存在硫醚的有效成分之一，是绿色、安全的天然添加剂[3]，并且具有特有的风味及良好的抑菌、抗肿瘤、抗癌等特性[4]。

产志贺毒性大肠杆菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli，STEC）能引发一系列的人类疾病，包括出血性肠炎（HE）、水样腹泻、溶血性尿毒综合征（Hemolytic-uremic syndrome，HUS）、血小板减少性紫癜（TTP）等。截至目前，由STEC引起的胃肠道疾病的爆发情况显示，这种病原体已经成为威胁人类健康最重要的病原体之一[5]。至今，已报道的由STEC引发的人类疾病，除了包含O157∶H7血清型之外，还有其它血清型，例如：O111，O26，O146 等，也占有重要比例[6]，因此，非O157产志贺毒性大肠杆菌的研究也尤为重要。STEC相关毒力因子的表达是其致病性的关键，志贺毒素（Shiga toxin，stx）是主要的毒力因子，Stx 家族由Stx1基因和Stx2基因组成，能够特异结合到许多组织的内皮细胞，从而引发各种疾病[7]。eaeA是紧密黏附素基因，它编码的蛋白有助于细菌黏附在肠黏膜不被排出；ehxA基因编码EHEC溶血素（EHEC－hemolysin，ehxA）是一种用普通方法检测不到的特异性溶血素，与出血性肠炎等疾病密切相关[8]。

本文以二烯丙基二硫醚为试验原料，探究DADS对大肠杆菌的作用机理及生物学特性，研究其对非O157产志贺毒性大肠杆菌的抑制作用。选取其亚抑菌浓度对大肠杆菌作用，采用实时荧光定量PCR的方法，探究非O157产志贺毒性大肠杆菌中典型毒力因子stx2，eaeA和ehxA的表达情况，研究其对大肠杆菌游动能力的影响，为后续研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌种

产志贺毒性大肠杆菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli，STEC）编号：CICC 10670，中国工业微生物菌种保藏管理中心（China center of industrial culture collection，CICC）。

1.2 材料与试剂

二烯丙基二硫醚（Diallyl disulfide，DADS），美国Sigma公司；氢氧化钠、琼脂粉、牛肉膏、蛋白胨、氯化钠，博诺试剂公司；RNAprep pure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒，根生化科技（北京）有限公司；SYBRPremix Ex TaqTM，宝生物工程（大连）有限公司；RNase-free Water、荧光定量PCR用引物，生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 仪器与设备

ZHJH-C1112C超净工作台、恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司；YSQ-LS-50Sll立式压力蒸汽灭菌锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；DPR-9162电热恒温培养箱、DGG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱，上海森信实验仪器有限公司；202-OAB电热恒温干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司；电子分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；UV-1750型紫外分光光度计，日本岛津仪器有限公司；微量台式离心机，Thermo Scientific；MyiQ TM 2 型荧光定量PCR仪，美国BIO-RAD公司。

1.4 试验方法

1.4.1 培养基的配制 牛肉膏蛋白胨培养基：蛋白胨 1 g，牛肉膏 0.3 g，氯化钠 0.5 g，琼脂 1.5 g，去离子水100mL，调pH值至7.0左右，121℃下灭菌20min。

Swimming 培养基：蛋白胨 1 g，NaCl 0.25 g，琼脂0.3 g，去离子水100mL，121℃下灭菌20 min。

1.4.2 菌种的活化 取-80℃冻存的菌液，吸取50μL置于5mL液体培养基中，150 r/min振荡培养24 h，第一次活化；将上述菌液划平板过夜培养，第二次活化；挑取平板上的单菌落，转接至液体培养基中用于后续试验。

1.4.3 硫化物的处理 根据已知原液的分子质量和密度，按照如下公式稀释DADS至所需浓度，半数稀释至适当浓度，密封备用[9]。公式如下：

式中，n——摩尔质量，mol/L；M——分子质量；m——原液质量，g；ρ——密度，g/mL；V1——加入原液的体积，L；V总-V1——加入溶剂的体积，L。

1.4.4 最低抑菌浓度的测定 按照公式稀释DADS至5mol/L，再半数稀释为所需浓度。加入1 mL菌液到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，吸取40 μL不同浓度的DADS分别加至100mL液体培养基中，致 DADS 终浓度达到 4，2，1，0.5，0.25，0.125,0.625mol/L，充分振荡均匀，于37℃培养箱中培养，在12 h内，利用紫外分光光度计每隔3 h测量其OD600值，绘制生长动力学曲线。以OD600值为纵坐标，时间t为横坐标，绘制试验组和对照组生长曲线。与对照相比，若有细菌生长，记为阳性（+）；若无细菌生长，记为阴性（-）。以无细菌生长的DADS最低浓度记为MIC。每个浓度3组平行，试验结果取平均值。添加等体积DMSO作为阴性对照[10]。

1.4.5 RNA的提取及cDNA的合成 参照Upadhyay等和Knudsen等[11-12]，在牛肉膏蛋白胨培养基中，分别添加不同亚抑菌浓度DADS，以未添加DADS的作为对照组，培养12 h，取适量的菌液按照细菌总RNA提取试剂盒说明书步骤提取RNA，用琼脂糖凝胶电泳检测，并用酶标仪测得OD260/OD280比率，检测RNA纯度。

1.4.6 引物设计 根据GenBank中大肠杆菌基因全长序列为模板，设计stx2、eaeA、ehxA的上下游引物序列，另外内参基因16SrRNA的上下游引物序列来自Andino等[13]的报道，4种基因的bp长度在200以内。引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列及扩增片段长度见表1。

1.4.7 实时定量荧光PCR 用实时荧光定量PCR仪测定stx2、eaeA、ehxA基因在亚抑菌浓度DADS作用下的相对表达量。RT-qPCR反应条件如下：初始变性 95℃，1min后，95℃，20 s；62℃，20 s；80℃，15 s反应40个循环，60℃处停留 15 s。在60℃时进行荧光信号采集，反应结束后，系统根据荧光值的变化规律自动生成熔融曲线。得到目的基因和内参基因的Ct值，用2-⊿⊿Ct法计算相对表达量[14]：

表1 实时荧光定量PCR引物Table1 The qRT-PCR primers

1.4.8 DADS对大肠杆菌游动能力的影响 方法参考Abreu等和Butler等[15-16]大肠杆菌游动能力的抑制试验，取1mL大肠杆菌种子液接种于100 mL液体培养基中，37℃，150 r/min培养18 h。将20mL泳动培养基灭菌后冷却至45℃左右时，分别加入不同浓度DADS溶液，加生理盐水作为阳性对照。倒板，取3μL菌液点到平板中央。培养18 h后，用游标卡尺测量扩散圈直径，根据扩散圈直径大小判断DADS对大肠杆菌游动能力的抑制作用。

2 结果与分析

2.1 DADS对大肠杆菌的最低抑菌浓度影响

DADS对大肠杆菌有明显的抑菌作用。DADS对大肠杆菌最低抑菌浓度见表2。通过测定，当DADS的添加浓度大于2mmol/L时，抑制大肠杆菌的生长。该结果与前期研究相一致[17]，DADS对革兰氏阳性菌包括大肠杆菌有良好的抑制效果。与吴楠等[18]的研究结果相符，以大蒜精油为原料研究对包括大肠杆菌在内8种菌的抑菌效果，提取的大蒜精油中DADS占19.35%。DADS对大肠杆菌生长曲线的影响如图1所示，阳性对照组大肠杆菌生长曲线呈正常典型的生长曲线，在DADS浓度为MIC时，DADS可以明显抑制大肠杆菌生长，使细菌无法生长，1/2MIC的DADS使细菌无法进入对数生长期，非典型生长状态，曲线平缓。在1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC和1/32MIC的DADS作用下，大肠杆菌虽然可以进入对数生长期，但由于DADS的抑制作用，生长数量处于略低状态，吸光度值始终低于阳性对照组。培养12 h时，阳性对照组的OD600值达到1.31，而1/2MIC的DADS的OD600值为0.73。DADS对大肠杆菌的抑菌作用在1/4MIC～MIC之间具有一定的浓度依赖性。

2.2 RNA提取的结果

RNA提取结果如图2所示，分别为未添加DADS的对照组和添加 1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC和1/32 MIC的DADS试验组。琼脂糖凝胶电泳显示条带清晰，提取浓度和纯度都符合要求，满足后续试验要求。

表2 二烯丙基二硫醚对大肠杆菌的最低抑菌浓度Table2 Minimum antibacterial concentration of diallyl disulfide

图1 DADS对大肠杆菌生长曲线的影响Fig.1 Effect of Diallyl disulfide on the growth curve of E.coli

2.3 二烯丙基二硫醚对大肠杆菌毒力基因表达的影响

探究二烯丙基二硫醚（DADS）对非O157产志贺毒性大肠杆菌毒力因子stx2，eaeA，ehxA表达的影响。结果如图3所示，随着二烯丙基二硫醚添加量的增加，3种毒力基因的相对表达量都呈浓度依赖性。与未添加DADS组相比，DADS浓度为1/4MIC时，stx2基因的表达量降低了90.37%，有显著差异性，而当浓度为1/32MIC时，stx2基因的表达量也下降了43.42%，当浓度为1/4MIC时，eaeA基因的相对表达量降低87.05%，ehxA基因降低了91.74%。

图2 大肠杆菌总RNA琼脂糖凝胶电泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of RNA samples for E.coli

图3 DADS对大肠杆菌相关毒力基因表达的影响Fig.3 Effect of DADS on related virulence genes of E.coli

不同抑制剂对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的毒力基因均有抑制作用，对革兰氏阴性菌毒力基因表达的影响：马宗兵等[19]在研究大蒜素对副猪嗜血杆菌抑制作用机理时，通过定量PCR分析发现，通过8μg/mL和16μg/mL大蒜素处理的副猪嗜血杆菌，溶血毒素基因hhdA、mviN以及抗生素外排泵基因norM表达下调，结果说明含硫化合物对副猪嗜血杆菌有明显的抑制效果，并且可抑制溶血毒素、毒力因子以及抗生素外排泵等基因的表达。Crane等[20]以锌为抑制剂研究产志贺毒性大肠杆菌stx基因及其相关蛋白的表达，浓度为0.4mmol/L的锌可以抑制stx1和stx2的表达，抑制率达到90%以上。对革兰氏阳性菌毒力基因表达的影响：Shi等[21]得到类似结论，在37℃和4℃下，Nisin对单核细胞增生李斯特菌毒力基因inlA，prfA，plcA和hlyA均有一定程度的抑制，Nisin浓度越高，毒力基因表达量越小；亚抑菌浓度鱼腥草醇提物对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌α-溶血素呈剂量依赖式抑制[22]。

此外，其它研究结果表明，外源抑制剂不仅对大肠杆菌有应答，对真核细胞也有抑制作用，如Di等[23]得到结论，在研究果胶寡糖对大肠杆菌O157∶H7黏附性和HT29细胞志贺毒素毒性影响时发现，在HT29细胞中POS1抑制志贺毒素效果最好，并呈现一定的浓度依赖性。

图4 DADS对大肠杆菌游动能力的影响Fig.4 Effect of DADS on swimming ability of E.coli

图5 DADS对大肠杆菌游动能力的抑制率Fig.5 The inhibition rate of DADS on swimming ability of E.coli

2.4 DADS对大肠杆菌游动能力的抑制作用

添加不同浓度的DADS对大肠杆菌游动能力的影响如图4和图5所示，亚抑菌浓度下的DADS即可抑制大肠杆菌的游动能力，并呈浓度依赖性。与对照组相比，当添加1/4MIC的DADS时，即0.5 mmol/L，大肠杆菌产生的扩散圈直径为（24.6±0.6）mm，抑制率达到 61.18%，添加 1/8MIC、1/16MIC和1/32MIC的DADS，大肠杆菌扩散圈的抑制率分别达到52.42%，29.38%，8.86%。随着DADS添加浓度的增加，大肠杆菌的迁移能力减小，迁移距离缩短，游动能力降低。

在其它外源抑制剂对微生物游动能力的研究中，Abreu等[15]也得到类似结论，以异硫氰酸酯类的异硫氰酸苯乙酯（PITC）为原料，PITC抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的游动能力。游动能力与鞭毛基因有关，杨丙烨等[24]在研究西瓜细菌性果斑病菌鞭毛基因fliS的功能分析时，得到结论：即鞭毛基因fliS对果斑病菌鞭毛丝的形成、游动性、菌膜形成能力、生长速率、菌落形态、致病性等均有调控作用。游动能力和黏附基因也有关，Iversen等[25]研究肠出血性大肠杆菌毒力基因调控得到的结论。Li等[26]研究表明1/16MIC和1/32MIC的石榴皮对沙门氏菌群体感应系统（QS）、毒力因子有抑制作用，对沙门氏菌的游动能力有明显的抑制作用，结果表明，石榴皮作为群体感应抑制剂对毒力基因和游动能力都有一定的调控作用。

图6 DADS对大肠杆菌游动能力抑制作用Fig.6 Inhibition of the swimming ability of E.coli by DADS

3 结论

经测定，DADS的MIC是2mmol/L。在不同浓度二烯丙基二硫醚（DADS）的作用下，非O157产志贺毒性大肠杆菌的生长受到不同程度的抑制，当DADS的浓度为MIC时，大肠杆菌完全不生长；当浓度为1/2MIC时，抑制大肠杆菌生长；当浓度为1/4MIC到1/32MIC时，对大肠杆菌没有抑制作用。添加亚抑菌浓度的二烯丙基二硫醚后，与对照相比，stx2、eaeA和ehxA基因均下调，并呈浓度依赖性。随着DADS添加浓度的增加，大肠杆菌的游动能力减小，呈浓度依赖性。本试验以含硫香料作为健康、高效的抑菌剂，为今后应用于食品行业提供理论依据，为研究致病性大肠杆菌提供了新的思路。