带鱼副产物鱼粉对酱醪品质的影响

许 钲 位正鹏 霍健聪，3* 刘亚楠 张思佳

（1 浙江海洋大学食品与医药学院 浙江舟山 316000

2 荣成泰祥食品股份有限公司 山东荣成 264300

3 浙江省海产品健康危害因素关键技术研究重点实验室 浙江舟山 316000）

带鱼是舟山渔场传统四大海产之一，也是近年来仅有的仍能维持渔汛的海产之一[1]。据《舟山市2015年国民经济和社会发展统计公报》统计，2015年舟山带鱼产量达11.71万t，位居各海水鱼产量之首。带鱼加工过程中会产生包括鱼头、鱼尾、鱼骨及内脏等大量加工副产物，约占鱼体重的40%～45%[2]。带鱼副产物中含有大量蛋白质，国内外学者对水产品加工副产物的利用研究主要在生产鱼油、鱼露、水解蛋白方面，可是仍存在工艺扩大失真，生产成本高等问题[3-5]。如何高效利用这类蛋白资源成为当前的研究热点。

洛泗座油是浙江舟山市知名特产，以其色深汁浓、酱香醇厚、咸甜适中、滋味鲜美、久藏不霉等特点深受人们青睐。酱醪的发酵和陈化是酿造高品质酱油的关键步骤之一。发酵过程中，大豆蛋白在多种微生物分泌的生物酶的共同作用下，进一步分解成氨基酸、肽等小分子物质，赋予酱油独有的风味。目前，国内绝大部分酱醪中的蛋白均以大豆蛋白为主，关于酱醪品质的研究也多集中于酱醪发酵过程中微生物区系变化，以及发酵工艺对酱油品质的影响，而对酱醪制备过程中蛋白成分对酱醪品质影响的研究成果寥寥无几[6-8]。基于这一情况，本研究将舟山带鱼加工副产物添加到酱醪中，探讨添加带鱼副产物蛋白对酱醪品质的影响，不仅有望进一步提高舟山酱油的风味品质，而且为带鱼加工副产物的综合利用提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

带鱼加工副产物（整条带鱼经采肉后的剩余部分），浙江兴业集团有限公司。副产物到实验室后进行绞碎、烘干（水分含量4.20%）、粉碎（过80目筛），密封后冰箱冷藏室贮藏备用；酱油种曲，上海佳民酿造食品有限公司，为蛋白酶和淀粉酶活性较高的中科3.951（即沪酿3.042）米曲霉孢子；鲁氏酵母为实验室自备（提前配制成108个/mL的菌悬液）；其余原料如大豆、面粉等均为市售；试验用甲醛、盐酸、福林试剂等常用分析纯级化学试剂、乙腈等色谱用色谱纯级试剂，国药集团上海化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器及设备

紫外分光光度计（U-2800），日本日立公司；固相微萃取设备（SUPELCO，57330-U），上海楚定分析仪器有限公司；萃取头（100μm PDMS，聚二甲基硅氧烷），北京康林科技有限责任公司；气质联用设备（安捷伦7890B），美国安捷伦科技有限公司；其余均为实验室常用设备。

1.3 试验方法

1.3.1 酱醪制备 参考舟山裕大酿造有限公司酱醪制备工艺。首先制备酱油曲：优质黄豆1 000 g，加入1.3倍的水，浸泡过夜后（10 h）蒸汽灭菌处理（100℃，20min），蒸汽处理后的黄豆冷水冲淋至40℃后沥干，并拌入300 g面粉，搅拌均匀后加入1.95 g种曲（即原料质量的0.15%）和10mL鲁氏酵母菌悬液，同时分别加入占曲料质量分别为2.0%（A组）、4.0%（B组）和6.0%（C组）的带鱼副产物鱼粉（以不加鱼粉为对照），酱油曲进行后期培养，培养温度33℃，培养时间12 h，翻曲1次，24 h后再翻曲1次；而后培养温度降低至28℃，继续培养36 h后制曲结束；酱油曲制备好后放到玻璃罐中，按1∶2.1的比例加入质量分数为18%的食盐水后密封罐体，置于培养箱中恒温发酵（30℃）。前1周每天用玻璃棒翻搅1次，1周后每3 d翻搅1次，到30 d时发酵结束。

1.3.2 酱油曲酵母总数、孢子数量及质量评定孢子及酵母菌数的测定分别参考SB/T 10315-1999和GB 4789.15-2010；同时观察不同时间酱油曲的外形色泽品质。

1.3.3 蛋白酶活力的测定 蛋白酶活力测定参照GB/T 23527-2009，即40℃下水解酪蛋白每分钟生成1μg酪氨酸所需的酶量，定义为1个蛋白酶活力单位。

1.3.4 酱醪中氨基酸态氮测定 氨基酸态氮参考国标GB18186-2000，采用甲醛滴定法测定。

1.3.5 挥发性风味物质鉴定 参考冯笑军等[9]的方法，略有变动，具体操作：称取10 g样品置于100mL螺口瓶中，加入24mL蒸馏水和8 g NaCl，聚四氟乙烯密封后于磁力搅拌器上60℃搅拌处理15min，而后用DVB/CAR/PDMS（二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷）萃取头吸附60 min，插入气相色谱进样，解析5min。色谱柱采用安捷伦毛细柱，升温速度2℃/min，到90℃后保温5 min；而后升温速度调至8℃/min，到250℃后保温1min；载气为氦气，流量1.0mL/min；质谱条件：电子能力80 eV，电压350 V，离子源温度240℃，四极杆温度150℃，质量扫描范围m/z 50～450。测定完毕后进行定性定量鉴定，其中定量鉴定采用面积归一化法，定量鉴定参考风味物质数据库。

1.3.6 数据处理 用SPSS 13.0对数据进行分析。利用ANOVA方差分析软件进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 酱醪制曲过程中种曲孢子及酵母菌数量的变化

图1和图2分别是酱油曲制备过程中鲁氏酵母数和米曲霉孢子数变化。由图1可以看出，在制曲的4～20 h阶段包括对照组在内的各试验组中，酵母总数均呈上升趋势，之后各组酵母总数反而降低，各处理组在制曲过程中均显著高于对照组（P＜0.05，除4 h外）。酵母总数的变化可能与曲料水分含量有关，制曲开始阶段曲料水分含量较高，适于酵母生长，而后期随着水分蒸发，生长环境对酵母数量增殖不利；而对孢子而言（图2），在制曲过程中36 h时各组孢子数均达到 8.5×108/g以上，在相同制曲时间下，总体来看，各试验组与对照之间差异不大，表明添加的带鱼鱼粉对米曲霉生长无任何影响。

2.2 酱醪制曲过程中蛋白酶活力的变化

图1 制曲过程中酵母菌总数变化Fig.1 The changes of the total number of yeasts in koji-making

图2 制曲过程中孢子总数变化Fig.2 The changes of the spores in koji-making

图3 发酵过程中蛋白酶活力变化Fig.3 Protease activity changes during fermentation

蛋白酶是影响酱油质量的关键指标，酱油中氨基酸态氮、短肽等风味物质的形成都是蛋白酶的贡献[10]。此外，蛋白酶降解蛋白形成的氨基酸也是酱油中的酯等重要风味物质形成的前提[11]。沪酿3.042米曲霉是一种广泛用于酱油生产的优质曲霉菌种，具有适应性好，蛋白酶活力高，分泌蛋白酶种类多等优点。从图3可以看出，除24 h外，其余发酵时间内各处理组的蛋白酶活力均显著高于对照组（P＜0.05），表明添加带鱼鱼粉对酱油曲的酶活力有正向促进作用；此外，各试验组间也表现出不同的蛋白酶活力，发酵时间28 h时，各试验组间蛋白酶活力存在显著性差异（P＜0.05），此后A组同B、C两组间均存在显著性差异（P＜0.05），而B组、C组间差异不显著，表明带鱼鱼粉添加量增大后对蛋白酶活力提升无显著作用。除带鱼鱼粉外，前期研究发现，在酱油曲的制备过程中添加1.3%的北太鱿鱼骨骨粉也有类似效果，这可能同鱿鱼骨及带鱼鱼粉中蛋白质含量较高有关。

图4 制曲过程中不同发酵时间种曲外观形态变化Fig.4 Morphological changes of soy sauce koji during different fermentation time

2.3 酱醪发酵过程中外形色泽变化

图4是B组酱醪发酵过程中的外形和色泽变化。从图4a中可以看出，发酵时间为20 h的酱油曲表面附着有大量黄绿色菌丝，菌丝蓬松柔软，同时曲料也较为松散，有特殊的曲香味，无酸味、氨味等不良异味；图4b是曲料加盐水继续发酵后12 d的图片，从中可知酱醪黏度较高，大部分大豆外形不完整，酱醪呈诱人的黄褐色，有酱醪特有的酱香味，然而流动性较差；继续发酵到30 d后，大豆基本全部破碎，酱醪黏稠度增加，流动性变差，而色泽基本不变，且酱香味更加浓郁。同B组相比，除带鱼鱼粉添加过多（图4d，C组）会导致酱醪的流动性明显降低之外，其余试验组和对照组在外观色泽上相差不大，表明添加带鱼鱼粉对酱醪外观和色泽影响不显著。

2.4 酱醪发酵过程中氨基酸态氮变化

一般而言，酱油中氨基酸态氮含量越高，酱油品质越好，因而氨基酸态氮是衡量酱油品质的重要指标[12]。酱醪发酵过程中氨基酸态氮变化如图5所示。从图中可以看出，在30 d的发酵过程中，各组的氨基酸态氮含量持续增加，其中试验组氨基酸态氮含量普遍高于对照组，到30 d时分别高于对照组14.5%，18.8%和19.4%。由此可知，添加带鱼鱼粉对酱醪品质有较为显著的提升效果。前期研究发现带鱼副产物营养丰富，其中粗蛋白、粗脂肪含量分别达到15.36%和10.35%，水解后的副产物含有多种必需氨基酸，其中异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、苏氨酸、色氨酸及缬氨酸达到FAO/WHO（1973）提出的理想氨基酸模式中相应氨基酸的88%～100%[13]。较高的蛋白含量和质量可能为酱醪中各种微生物提供了更为优质的氮源，从而提高了酱醪品质。

2.5 酱醪挥发性风味物质分析

图5 酱醪发酵过程中氨基酸态氮变化Fig.5 Changes of amino acid nitrogen during fermentation of soy sauce

表1是不同酱醪样品的挥发性香气成分检测结果（30 d）。由表1可知，所有样品检出成分可分为醇类、酯类、酸类、醛类、酚类及其它杂环化合物，共计33种，显著少于赵国忠等[14-16]的研究结果，这可能与检测方法、试验原料及发酵工艺有关，然而这一结果同前期添加鱿鱼骨粉的结果类似；从对照组与试验组的成分结果对比来看，大部分化合物成分含量均高于试验组，其各试验组挥发性成分总含量均明显高于对照组，表明添加带鱼鱼粉对酱醪主体成分具有一定促进效应；此外，尽管C组中挥发性成分含量比B组高3.16%，而值得关注的是C组高于B组的挥发性成分主要是辛醛、壬醛、庚醛和2-辛烯醛，而这些醛类物质广泛分布于鱼类中，是构成鱼腥味的主要化学成分，在酱醪的实际酿造过程中也发现，带鱼鱼粉添加量越高，则发酵后期酱醪的酱香味中鱼腥味也越明显，这可能与鱼粉新鲜度或鱼粉自身化学成分有关。

表1 酱醪挥发性风味物质成分SDE/GC-MS分析结果（30 d）Table1 The result of volatile flavor compounds analyzed by GC-MS（30 d）

（续表1）

3 结论

添加适量带鱼鱼粉对酱醪制曲过程中米曲霉的生长及蛋白酶等有一定促进效应，米曲霉孢子数和酵母数均高于对照组，其中带鱼鱼粉添加量为4%的B组显著高于A组，然而同C组无显著差异；在发酵过程中添加带鱼鱼粉对酱油曲和酱醪的色泽、香气、流动性等方面无明显影响，而加入过多鱼粉会导致酱醪流动性降低；鱼粉的加入可提高酱醪氨基酸态氮含量，这可能与鱼粉中优质蛋白含量较高有关；30 d时各组酱醪中挥发性成分种类基本相同，而4%试验组中挥发性成分较高，且辛醛、壬醛等具有鱼腥味的成分含量较低，且挥发性成分含量显著高于对照组，对酱醪品质有一定的提升作用。