T-SPOT.TB联合基因芯片检测在老年肺结核诊断中的应用

孙桂英 赵刚 高胜利 黄媚 俞净 钮志林

(苏州市第九人民医院感染科，江苏 苏州 215200)

结核病是由结核分枝杆菌诱发的一种慢性传染性疾病，对机体诸多重要脏器均有侵袭性，临床以肺部结核感染最为常见〔1〕。机体在感染结核菌之后并不一定发病，只有在细胞介导变态反应增高或抵抗力减弱后，才可能发病，疾病早期若得到及时的诊断及合理的治疗，大多可治愈〔2〕。至今，结核病的病原学诊断依然依赖于培养法与涂片法，其中涂片法的应用敏感度与特异度均较低，而作为金标准的培养法，在进行药敏试验时需要耗费较长的时间，至少需要4 w才能获得确切的结果，加之该技术操作程序繁琐、重复性较差，临床应用受到限制〔3，4〕。故找到一种新型、快速且准确的检测技术，快速完成结核分枝杆菌检测与耐药性分析，对争取治疗时间、改善预后意义重大。随着现代分子生物学及基因学检测技术的发展，各类新型检测技术的出现为结核病的早期快速诊断带来希望。基因芯片技术是一种核酸检测手段，能够对结核分枝杆菌各主要基因及常见突变位点快速检测，并很好地鉴定其他非结核分枝杆菌菌属〔5〕。除基因芯片检测外，T-SPOT.TB技术的应用对结核病诊断也有重要价值〔6〕。本研究主要观察T-SPOT.TB与基因芯片联合检测用于老年肺结核诊断的临床价值，以指导未来老年肺结核的早期诊断。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择苏州市第九人民医院300例在2016年6月至2019年6月门诊或住院高度疑似肺结核的患者作为研究对象，全部患者接受痰标本检查、实验室生化指标检查、胸部影像学检查、诊断性抗结核治疗等临床手段。其中男167例，女133例；年龄60～90〔平均(72.47±6.44)〕岁；体重45～75〔平均(58.12±5.11)〕kg；主要临床表现包括：午后低热、乏力、盗汗、纳差、消瘦、咳嗽、咳痰、咯血、胸痛等。本研究的实施征得医院医学伦理委员会批准同意，全部患者及其家属对研究的开展知情同意。排除标准：心、肝、肾等重要脏器功能损害者，合并免疫系统疾病者，合并血液系统疾病者，合并其他感染性疾病者，合并恶性肿瘤疾病者，伴有精神疾病或心理障碍等无法很好地配合研究者。

1.2研究方法 全部检测方法所用试剂、染色液、培养液、显色液、均由珠海贝索生物科技有限公司提供。缓冲液、提取液、基因芯片、相关试剂盒等均由北京博奥生物有限公司提供。T-SPOT.TB联合基因芯片检测阳性判定：其中1项为阳性则可判定阳性。

1.2.1T-SPOT.TB检测 严格参照T-SPOT.TB试剂盒中的标准作业程序完成操作。采集全部纳入者的外周血5 ml，将其置于肝素抗凝管内，在室温下保存，并在4 h内完成标本的送检。在生物安全柜内使用密度梯度离心法对外周血提取单个核细胞，将提取所得的单个核细胞实施洗涤与提纯。使用显微镜行细胞计数，将阳性质控品、抗原、培养基等加入A板调控内，保证各板孔中有25万个外周血单个核细胞，培养板培养条件为：温度：37℃，5%二氧化碳，培养时间为16～20 h。缓冲液洗板，每孔内加入配置酶标二抗工作液50 ml，孵育1 h，孵育条件为2～8℃，再次缓冲液洗板，显色后使用蒸馏水洗板，终止显色后使用光学显微镜行细胞计数。结果判定：若阴性对照孔计数≥6，检测孔计数≥2倍的阴性孔计数，则判定为阳性，反之则为阴性。

1.2.2基因芯片法 利用基因芯片检测仪器处理标本并发现突变基因，操作步骤包括标本处理、提取核酸、PCR扩增、杂交反应、扫描芯片、自动判读。

1.2.3涂片检查 参照《痰片镜检标准化操作及质量保证手册》〔7〕中的相关要求操作。

1.2.4液体培养 使用BACTEC MGIT960培养基，参照《分枝杆菌分离培养标准化操作程序及质量保证手册》〔8〕中相关要求进行培养操作，全部涂片使用的标本需要进行培养检查。

1.3统计学方法 采用SPSS20.0统计学软件进行t检验、χ2检验、采用Kappa法检验T-SPOT.TB检测、基因芯片检测结核分枝杆菌与金标准的一致性(Kappa≥0.75代表高度一致，Kappa值范围为0.4≤且<0.75代表一致性较好，Kappa值<0.4代表一致性差)。

2 结 果

2.1液体培养与涂片检测结核分枝杆菌结果 300例老年高度疑似肺结核患者采集痰样本300份，经培养与涂片检测后结果显示，检出结核分枝杆菌者165例，阳性率为55.00%；其他135例未检出结核分枝杆菌，为阴性，阴性率为45.00%。

2.2T-SPOT.TB检测结核分枝杆菌结果 165例经液体培养与涂片检查结果呈阳性的患者经T-SPOT.TB检测结果显示，阳性者139例，阴性者26例；135例经液体培养与涂片检查结果呈阴性的患者，经T-SPOT.TB检测结果显示，阳性者42例，阴性者93例。整体符合率为77.33%(232/300)。将液体培养与涂片检查结果作为金标准，T-SPOT.TB检测用于老年肺结核诊断的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为84.24%(139/165)、68.89%(93/135)、76.80%(139/181)、78.15%(93/119)。T-SPOT.TB检测与金标准一致性Kappa值为0.537，一致性一般。

2.3基因芯片检测结核分枝杆菌结果 165例经液体培养与涂片检查结果呈阳性的患者经基因芯片检测结果显示，阳性者142例，阴性者23例；135例经液体培养与涂片检查结果呈阴性的患者，经基因芯片检测结果显示，阳性者11例，阴性者124例。整体符合率为88.67%(266/300)。将液体培养与涂片检查结果作为金标准，基因芯片检测用于老年肺结核诊断的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为86.06%(142/165)、91.85%(124/135)、92.81%(142/153)、84.35%(124/147)。基因芯片检测与金标准一致性Kappa值为0.773，一致性好。

2.4T-SPOT.TB联合基因芯片检测结核分枝杆菌结果 165例经液体培养与涂片检查结果呈阳性的患者经T-SPOT.TB联合基因芯片检测结果显示，阳性者160例，阴性者5例；135例经液体培养与涂片检查结果呈阴性的患者，经T-SPOT.TB联合基因芯片检测结果显示，阳性者32例，阴性者103例。整体符合率为87.67%(263/300)。将液体培养与涂片检查结果作为金标准，T-SPOT.TB联合基因芯片检测用于老年肺结核诊断的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为96.97%(160/165)、76.30%(103/135)、83.33%(160/192)、95.37%(103/108)。T-SPOT.TB联合基因芯片检测与金标准一致性Kappa值为0.751，一致性好。

3 讨 论

结核病是对人类健康有严重危害的传染性疾病，早期筛查与确诊对疾病的治疗及预后均有重要意义。痰涂片抗酸染色法是结核分枝杆菌早期检测的相对快速的方法，但该方法早期极易受到其他因素干扰，结果的灵敏度与特异度均较低，通常与痰培养结果联合判定〔9〕。痰培养被认为是相对准确的结核分枝杆菌检测方法之一，其在临床上多用作结核分枝杆菌“金标准”，但该检测方法操作繁琐，得到结果的时间相对较长，在实际应用中受到明显限制〔10〕。故找到一种新型的检测技术可以快速且准确的筛查出结核病是目前临床研究的重难点。

T-SPOT.TB技术主要通过测定结核分枝杆菌的特异性抗原来刺激机体生成γ-干扰素水平表达来判定机体是否被结核杆菌所感染，因卡介苗缺乏这些特异性的抗原，故经T-SPOT.TB技术检测出来的阳性结果基本可以将因卡介苗接种引起的假阳性排除〔11，12〕。此外，T-SPOT.TB技术使用的标本主要为体液或血液，更容易获取，在临床中的应用更具推广价值〔13〕。本研究结果发现，T-SPOT.TB技术用于老年肺结核诊断的灵敏度虽理想，但特异度相对较低，且与金标准的一致性一般，故还应考虑将其与其他技术联合使用，以提高诊断价值。基因芯片技术是近几年逐渐被临床关注的一种新型技术，该技术是将玻璃等固相作为载体，通过高密度的方式将生物信息分子固定，并将需要检测的样本DNA或RNA同探针杂交，并在杂交后通过特定的仪器与系统进行扫描与显色，量化后对杂交结果进行分析，从而得到想要的检测结果〔5，14〕。基因芯片技术在分子突变的检测中，不仅能够了解基因突变的位点及类型，同时还可以测定多个基因乃至整个基因组所产生的突变，相较于其他同类检测技术，其具有高灵敏度的特点〔15，16〕。陈蕾〔17〕研究发现，将基因芯片检测用于结核病的早期筛查诊断有着较高的临床价值，不仅能够快速检测出样本中结核分枝杆菌感染情况，还能检测结核分枝杆菌对异烟肼、利福平等耐药突变，鉴别出其他非结核分枝杆菌属。本研究结果显示，基因芯片与T-SPOT.TB联合检测诊断老年肺结核的特异度虽较基因芯片技术单独使用有一定降低，但其整体的灵敏度、阴性预测值得到提高，说明二者联合应用仍较单独应用具有更为关键的价值。可减少老年肺结核早期漏诊，且与金标准有较好的一致性，可考虑将其作为老年肺结核早期主要筛查诊断方法。