犬间充质干细胞在兽医临床的应用

胡瑭琦 ， 李秋艳 ， 钟友刚

(1.中国农业大学动物医学院 ， 北京 海淀 100193 ； 2.中国农业大学生物学院 农业生物技术国家重点实验室 ， 北京 海淀 100193)

间充质干细胞是一种具有自我更新能力且能分化为其他细胞类型的细胞，因其具有较大的治疗潜力，近年来在宠物疾病诊疗方面逐渐成为研究热点。本文概括了利用犬间充质干细胞治疗犬的几种疾病及其研究进展，包括骨关节炎、心脏病、糖尿病、神经损伤等治愈率较低的疾病；同时对干细胞治疗的现状进行总结，为今后开展犬及其他宠物疾病干细胞治疗的研究、应用提供参考依据，促进宠物诊疗行业的发展。

1 简介

干细胞(Stem Cell)是一类可以进行自我复制的多能细胞[1]。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell，ESC)和成体干细胞(Somatic Stem Cell，SSC)。成体干细胞可以从许多分化的组织中获得，包括骨髓、脂肪和肌肉等[2]。成体干细胞又包括间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs) 和造血干细胞。

大多数研究所讨论的成体干细胞实际上是间充质干细胞。从20世纪80年代开始，多个研究小组先后证实了间充质干细胞可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、成肌细胞等各胚层细胞,是再生医学领域的理想种子细胞。目前，大多数犬、猫临床试验使用的间充质干细胞主要为骨髓间充质干细胞(BMSCs)、脂肪间充质干细胞(ADMSCs)和脐带血来源间充质干细胞(UCBMSCs)。

干细胞疗法在近代科学研究中是一个创新领域，通过用干细胞产生的健康细胞替代组织内的受损细胞以达到治疗疾病的目的[2]。干细胞疗法中，成体干细胞是目前研究最多、成功率最高的细胞来源，其再生特性以及它们可改变受伤和患病组织周围环境的能力使得许多疾病的治疗成为可能。特别是间充质干细胞(MSCs)，它们易于获得、分离和培养扩增；可以迁移到受损区域、支持其他细胞生长以及减弱机体免疫反应。有研究证实，MSCs在静脉注射后具有向全身特别是向缺氧或损伤组织区域迁移的能力[3]；注射后也没有发现严重的副作用以及肿瘤的形成[4]。近几年，间充质干细胞疗法在人类医学上的应用效果显著，其应用价值已经在心血管、神经学和免疫疾病的临床试验中得到了广泛证实。

随着经济水平的提高，越来越多的人开始关注自身宠物的健康，对于宠物疾病治疗的诉求日渐增加，其中犬是饲养数量最多也是宠物临床行业最关注的种类。由于人与犬的基因序列同源性大于人与啮齿动物的基因序列同源性，二者在生理特点和疾病(尤其是遗传病)上都具有相似性，因此在发展人类干细胞疗法的过程中，犬常被用作主要的实验动物，这也为干细胞疗法在治疗犬类疾病上的应用奠定了基础[5]。

2 间充质干细胞治疗犬类疾病的应用

2.1 骨关节炎 骨关节炎(OA)是由于分解代谢和合成代谢失衡导致犬、猫出现慢性疼痛的常见原因，可导致关节软骨和软骨下骨的退化、侵蚀。常规治疗方法如注射甾体和非甾体抗炎药(NSAIDs)可以缓解疼痛，但不能促进其恢复。另外，NSAIDs具有肾毒性，应避免长期用药。兽医临床上OA的干细胞治疗试验主要是针对犬的髋关节和肘关节，并且主要采用的是ADMSCs进行治疗性试验。Vilar 等[6]采用髋关节内单次注射ADMSCs，同时与富含生长因子(PrP)的关节内自体血小板或透明质酸(HA)一起用作软骨保护剂，分别比较了ADSCs-PrP、ADSCs-HA和ADSCs-SVF(新鲜基质血管组分)的治疗效果，结果表明，这3组对于患犬后肢功能恢复都有显著改善。Black等[7]的一项双盲试验同样表明，ADMSCs可以改善髋关节炎患犬的跛足、疼痛和运动范围评分。

随后，该实验室[8]与Guercio等[9]先后证实ADMSCs还能治疗犬肘关节炎。除此之外，还有学者将自体ADMSCs用于治疗犬膝关节炎，结果显示，膝关节骨赘和软骨下囊性病变均有减轻[10]。

2.2 骨缺损 在人类和宠物，特别是犬上，干细胞疗法对于改善骨折、节段性缺损、骨愈合，改良用于全关节置换的植入物以及关节融合术都有着重要的临床意义。美国塔夫斯大学治疗学实验室先后研究了自体和同种异体BMSCs对于骨缺损的治疗效果，结果发现，采用合适的生物支架结合BMSCs的治疗方法，都可以增强长骨缺损中的骨再生能力，且不会发生免疫排斥反应[11-12]。

除了长骨骨缺损外，MSCs在犬下颌骨重建以及继发于牙周病的骨吸收修复方面都具有临床应用潜力[13-15]。因此基于MSCs的治疗可以在各种临床相关条件下改善骨形成，从而应用于兽医临床。

2.3 神经肌肉损伤 脊髓损伤是导致犬运动和感觉功能障碍的重要临床疾病，通常继发于椎间盘疾病(IVDD)以及其他退行性或创伤性原因，不仅对患犬的生活质量造成影响，也加大了主人的饲养负担。一些研究表明，MSCs移植可以改善犬脊髓损伤试验模型中功能性神经的恢复，Ryu等人[16]评估了同种异体ADMSCs在急性脊髓损伤犬中的植入效果，磁共振成像和神经细胞组织病理学表明：治疗组相较于对照组在神经传导速度、体感诱导电位和神经功能上均有所改善。相关文献还对比了同种异体与自体ADMSCs对脊髓损伤后的功能恢复，结果显示，自体ADMSCs效果更好，但二者的作用效果都明显好于对照组[17]。Lim等[18]证明了脐带血来源间充质干细胞(UCBMSCs)对于犬脊髓损伤也有改善作用。除了单独使用MSCs进行治疗之外，有学者将ADMSCs预先分化为神经诱导性间充质干细胞(NMSC)，将基底膜与NMSC联合应用于脊髓损伤的犬上，结果显示出二者共同作用对神经功能具有更好的修复效果，除了减轻损伤处炎症反应外，还可以增加与神经元的延伸、其标志物以及神经营养因子相关的细胞因子的表达[19]。

MSCs除了有治疗脊髓损伤的可能之外，还可以有效治疗其他神经肌肉病变。如BMSCs可以促进犬坐骨神经损伤周围的神经再生和功能恢复[20]；肌原分化的MSCs可治疗犬杜氏肌营养不良症等等[21]。

2.4 心脏疾病 大约10%的宠物犬患有心脏病，包括心肌梗死和扩张型心肌病[22]，这强调了开发干细胞替代疗法来治疗心脏病患犬的必要性。虽然MSCs分化为心肌细胞的能力存在争议，但MSCs已被证明能显著改善犬的心脏功能及其存活率[23-24]。

Memon等[25]将自体BMSCs直接注射到犬心脏的受损部位，4周后彩超结果显示：治疗组犬的心脏功能与对照组相比有明显改善，这表明自体MSCs的输入性治疗手段能够促进心肌生成和血管再生，增强心脏功能。不仅如此，另有学者将BMSCs与手术相结合治疗犬心律失常，证明MSCs可以促进心房和心室肌的融合，改善传导缺陷[26]。这些研究都为犬心脏疾病的临床治疗提供了新的可行性方案。

2.5 炎性肠病 炎性肠病(IBD)是导致犬慢性胃肠疾病的常见原因，治疗方案大多是使用皮质类固醇药物抑制机体免疫反应，然而随着治疗时间的延长，这些药物不仅会使机体反应能力降低、临床症状复发，通常还会引起不良反应[27]。Merino等[28]对12只患有IBD的犬单次静脉注射同种异体ADMSCs，然后通过使用2种不同的临床评分系统(包括实验室诊断和体格检查)，持续监测42 d后，发现2项评分的指标都有所改善。

2.6 糖尿病 在犬上，最常见的糖尿病类型为1型糖尿病，这是由于胰腺中的β细胞分泌胰岛素不足导致的绝对或相对胰岛素缺乏所致，最终会导致β细胞功能丧失、低胰岛素血症、葡萄糖进入细胞受损以及肝糖原异生和糖原分解的加速[29]。临床上患犬表现多饮、多尿、多食、体重减轻的症状。1型糖尿病犬的β细胞功能丧失是不可逆的，终生使用胰岛素治疗是目前临床上治疗该病的主要措施。然而使用外源胰岛素控制血糖的效果受多种因素的影响，这使得患犬的血糖容易出现大范围波动，需要定期检查、长期监控，这些都非常消耗兽医与主人的时间和精力。

2012年，Kim等[30]成功将皮肤来源的MSCs诱导分化为功能性胰岛素生成细胞(IPC)，为治疗1型糖尿病提供了可能的β细胞来源。国内还有学者通过动脉介入技术，将导入了人胰岛素(INS)基因的犬BMSCs注射到糖尿病患犬的肝内，结果显示，该方法可以有效降低患犬血糖浓度，且肝脏病理切片也未检测到肿瘤的形成[31]。在此技术基础上，王丽梅等[32]将自体BMSCs移植到患犬胰腺内，结果表明：与对照组相比，治疗组的胰岛素使用量有所减少，在胰腺和肾脏内都检测到了BMSCs，病理切片也未显示任何异常改变。因此，利用MSCs的特性使机体恢复胰岛素分泌功能的这种替代疗法，可以作为临床治疗1型糖尿病的新思路。

3 展望

综上所述，干细胞疗法是一种较安全的方法，其中最具潜力的干细胞是MSCs，因为它们能够促进组织修复、激活细胞因子分泌、调节机体免疫、释放归巢信号。通过对犬间充质干细胞的研究和临床应用，可能为目前兽医临床上难以解决的病症提供有效的治疗手段，为未来宠物疾病治疗提供一个新的发展方向。

虽然干细胞疗法有巨大的临床应用潜力，但有必要进一步研究证实该方法对宠物临床患者的疗效确实性。因为不同实验室对MSCs的处理不尽相同，无法保证其同质性；对MSCs的基础性研究也不够系统和全面。所以制定规范的MSCs培养方案、探索其作用机制、优化临床治疗方案、避免副作用、建立宠物干细胞产品的技术标准及质量评价体系，对于MSCs广泛应用于宠物临床都是需要尽快解决的问题。这都需要更多优秀的科研工作者和宠物医生对宠物干细胞进行更深入的研究，为宠物临床奠定理论基础，提供技术保障，从而更好更快地推进宠物行业的发展。