非编码小RNA 对大肠杆菌致病性的调控研究进展

陈艳飞，王 亨，陈斌杰，朱国强*，孟 霞*

（1. 扬州大学 兽医学院，江苏 扬州 225009；2. 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009）

细菌在不同生境中增殖并适应不断变化环境的能力依赖于基因的快速表达和严格调节。在自然环境中，细菌经常遭遇温度、营养、酸碱度、铁离子浓度等条件的改变，为其生存和增殖带来巨大挑战和压力。为适应环境，细菌自身进化出一系列机制感应环境变化，并通过调整基因表达和蛋白活性来适应这些变化[1]。细菌sRNA 是一类在基因组中可被转录但不被翻译成蛋白质的RNA 分子。与蛋白质调控系统不同，当细菌遭遇不同环境胁迫时，sRNA 可与DNA 结合，抑制基因转录；或识别并结合靶标mRNA 后将其降解，抑制mRNA 翻译；或直接与相应蛋白结合，影响蛋白质活性，快速应答环境变化。并且当细菌进入宿主后，根据环境压力的变化调节自身毒力基因的表达，提高自身的生长、增殖和扩散[2]。细菌sRNA 长度通常为50 nt～400 nt，它们主要位于基因间区域，有的位于编码基因5'和3'UTR 区域，包括顺式编码的sRNA 和反式编码的反义sRNA，顺式编码的sRNA 有部分区域可与mRNA完全配对，因此不需要伴侣蛋白Hfq 的参与。而迄今为止在大肠杆菌中发现的sRNA 绝大多数是反义RNA，需要sRNA 伴侣Hfq 协助稳定sRNA 二级结构，促进靶标和sRNA 之间的识别与配对[3]。sRNA 具有多个靶标，可正向或负向调节多种基因的表达[4]。反义RNA 的另一个特征是在转录水平上受到严格调控，需要环境应激信号诱导表达。大肠杆菌属于革兰氏阴性菌，在自然界中以各种形式存在，从共生菌株（非致病性菌株）到人类或动物宿主的致病菌，是医学和兽医临床最常见的病原之一。大肠杆菌进入宿主体内后感应到环境的改变，sRNA 通过直接作用于毒力基因或调节毒力基因的表达，有效地促进细菌的生长、增殖、并破坏宿主的正常生理状态，有利于致病菌在宿主中的侵染和存活[5]。对多种与致病性和毒力相关sRNA 的研究发现，这些sRNA 在调控大肠杆菌铁稳态、碳代谢、应激反应、生物膜（Biofilm，BF）形成等方面发挥重要的作用[6-7]。本文就sRNA 对大肠杆菌致病性相关的调控作用展开阐述。

1 大肠杆菌sRNA 的发现

sRNA 是参与许多重要生物过程的调节因子，具有多样的生物学功能，并几乎存在于所有生物体中[8]。尽管1967 年在大肠杆菌中就发现了第一个sRNA-6sRNA，但之后由于测序技术发展限制，对sRNA 的研究缓慢，直到2001 年才发展到一个新的阶段。受益于微阵列比较基因组分析的应用对细菌中sRNA 的高效预测，将这些预测与系统实验筛选结合起来，鉴定了几十种新的反式作用sRNA[9]。2005 年广泛的全基因组筛选结果显示，大肠杆菌至少存在80 种sRNA[10]。随后许多新技术被用来预测和鉴定sRNA，例如Hyejin 利用PICKYv2.20 软件对大肠杆菌K12 进行全基因组热动力学分析，预测了大肠杆菌反式编码的sRNA，进一步利用全基因组嵌合芯片技术验证预测sRNA 的真实性。该方法能覆盖所有正链和负链上的基因和基因间区域，不仅可以证实预测的反式编码ncRNAs，还可发现顺式编码的ncRNAs[11]。然而由于sRNA 比较小，不翻译成蛋白质并且具有可变的稳定性，因此对其基因的预测仍然是一个巨大的挑战。

2 sRNA对大肠杆菌致病性的调控功能

2.1 调控BF 合成 细菌BF 是指细菌黏附于生命或非生命物体表面后将其包裹在自身分泌的多聚物中形成的一种细胞群落，组成细菌BF的胞外多聚物主要包括多糖、游离DNA、RNA、蛋白质、脂类和其他物质。BF提供机械稳定性并保护细菌免受各种不利环境的影响，如紫外线辐射，脱水等，并对抗生素具有很强的抵抗力。也提供了重要的细菌储库，对宿主有感染风险[12]。

卷曲菌毛（Curli）是由许多肠杆菌科细菌产生的聚集性菌毛，通过黏附等作用介导大肠杆菌侵袭宿主，作为细胞外基质的主要蛋白质成分，参与BF 的合成[13]。CsgD 是控制curli 生成的转录因子，目前已知不少于7 种sRNA（McaS、RprA、GcvB、RydC、RybB、OmrA 和OmrB）使用至少两种不同的机制抑制CsgD的表达[14]。一种是通过直接结合到核糖体结合位点（RBS）阻止核糖体翻译CsgD，另一种是诱导位于5'UTR 中的A/U 富集区域中csgD mRNA 的内切核糖核酸裂解，从而抑制翻译。CsgD 具有不寻常的长5'UTR，其作为转录后调控枢纽，涉及多种sRNA 结合位点和Hfq 结合位点。其中McaS（RprA 和GvcB）与Hfq（位于A/U 富集区）形成复合物[15]，将RNase E直接募集到A/U 富集区以诱导csgD mRNA 的裂解[16]。OmrA 和OmrB 结合翻译结合位点的上游以抑制起始核糖体的进入。McaS、RprA、GcvB 和OmRA/B 在位于核糖体结合位点远端均具有广泛的碱基互补配对。并且当OmrA 和OmrB 引起翻译抑制时，McaS、RprA 和GcvB 诱导csgD mRNA 的内切核糖核酸裂解。RydC 和RybB 在核糖体结合位点结合csgD 以抑制翻译起始复合物的形成[17]。7 种sRNA（McaS、RprA、GcvB、RydC、RybB、OmrA 和OmrB）抑制转录因子CsgD 的表达从而抑制curli 的产生，进一步影响BF 的合成。

2.2 调控致病性相关的不良环境介导的应激反应病原菌引起疾病是病原、宿主及环境三者相互作用的结果。病原菌侵入宿主体内，首先要适应宿主内环境。大肠杆菌经口进入消化道，并发挥致病作用引起人或动物的肠胃炎，与该菌适应宿主体内低氧、低铁、高渗透压和胃内酸性环境等不良环境并在其中存活密切相关。细菌sRNA 在感应宿主体内环境变化，调控相关基因的表达以适应环境而发挥重要调控作用，这种调控机制通常与RpoS 有关。RpoS（也称为σS）是细菌RNA 聚合酶的一种σ亚基，通过指导RNA 聚合酶识别不同的启动子，从而调节基因的表达[18]。当细菌遭遇酸胁迫、高渗、高温、氧化损伤、饥饿等不良环境条件时，sRNA 通过调控RpoS 的表达促进细菌生存所必需基因的转录[19]。例如sRNAsDsrA 和RprA 通过与rpoS mRNA 的5'非翻译区碱基配对激活转录因子RpoS 的翻译[20]。sRNA ArcZ 可通过碱基互补配对方式与rpoS mRNA 的5'非翻译区域结合激活RpoS 的翻译[21]。大肠杆菌在无氧环境中培养时ArcZ 的表达受到ArcA/ArcB 双组分系统的抑制，从而使RpoS 的表达水平降低。

酸性环境会杀死大部分微生物，但耐酸的大肠杆菌可以在这种压力环境中存活。大肠杆菌耐酸性主要是固定相表型，其大多数受固定相σ因子RpoS的控制，而RpoS 的表达受3 种sRNA ArcZ、RprA 和DsrA 的调控。在酸性（pH 2.5）M9 培养基中培养分别过表达ArcZ、RprA 和DsrA 的大肠杆菌，与野生菌株相比，3 株过表达菌株存活率均有所增加。其中DsrA 过表达菌株存活率最高。进一步研究证明DsrA和RprA 通过与rpoS mRNA 的5'非翻译区（5'UTR）碱基配对激活RpoS 的翻译，使该菌对酸胁迫产生有效的保护性反应。同时过表达其中两种或3 种sRNA，耐酸性超过野生菌株8 500 倍，并对氧化应激起保护作用[22]。这些小RNA 通过影响RpoS 的表达以抵抗自然界中一些逆境的胁迫，从而使细菌适应环境并生存。

2.3 维持胞外被膜完整性 细胞胞外被膜（Cell envelope）是抵御外部环境的最外层保护性屏障，可以保护细菌免受不良环境影响，并允许有害（如毒素）和有益分子（如营养素）的选择性通过[23]。胞外被膜的完整性对细菌存活至关重要，细菌通过监测胞外被膜的损伤或缺陷，控制细菌基因的表达以适应环境压力。革兰氏阴性细菌胞外被膜由磷脂双层的内膜（Inner membrane，IM）和外膜（Outer membrane，OM）两个同心膜层组成。而外膜由高丰度的外膜蛋白（Outer membrane proteins，OMPs）和脂多糖（LPS）组成。OMP 在细胞质中形成，具有为外膜提供通透性，维持外膜结构稳定的作用。

OM 可以作为阻止许多有毒分子进入细胞的选择性屏障，由于膜对于亲水性溶质而言是不可渗透的，因此孔蛋白如OmpF 形成的通道促进了营养素的吸收和有毒废物的排泄。其它不起通道作用的OMP 可以作为酶和粘附素，其对细菌的致病性影响主要是加强细菌的吸附能力[24]。目前大肠杆菌编码至少6 种sRNA（MicC、MicF、MicA、RybB、OmrAB和RseX）调控外膜蛋白的表达。MicC 通过与核糖体结合位点mRNA 序列碱基配对抑制了OmpC 的翻译。MicF 结合靶基因ompF mRNA，并通过抑制翻译降低OmpF 水平[25]。ompF 表达的下调在细胞对毒性和其他环境因素的响应中起重要作用。MicA 抑制ompA mRNA 的翻译和衰变，RybB 抑制ompC、ompW和ompN mRNA的翻译[26]。OmrA和OmrB在染色体上相邻编码，二者负调控cirA、fecA、fepA 和ompT 等多种外膜蛋白的表达[27]。RseX 作为多拷贝抑制因子参与抗σ因子RseA 释放σE。过表达RseX 可下调ompA 和ompC 的表达水平[28]。

脂多糖LPS 是革兰氏阴性菌细胞壁重要成分，为细菌提供渗透性屏障，LPS 修饰对细菌逃避宿主免疫防御，维持细菌存活至关重要[29]。其生物合成和 组 装 受σE 因 子 和sRNA 调 节[30]。GlmY 和GlmZ 是结构上同源的两种sRNA。GlmZ 与glmS 转录物碱基配对并通过稳定glmS 信息（message）促进其翻译，防止形成glmS 核糖体结合位点抑制结构[31]。但GlmY 缺少与glmS mRNA 的互补区，其通过抑制GlmZ 降解刺激GlmS 合成。Lpp 是大肠杆菌中最丰富的脂蛋白，含有3 个脂质链。Lpp 的耗尽增加了用于合成磷脂的游离脂肪酸库，有助于恢复磷脂与LPS 的平衡。sRNAMicL 与lpp 碱基配对后在翻译水平抑制Lpp 的合成[32]。MgrR 依赖PhoP/PhoQ 双组分体系表达修饰LPS，使细菌逃避宿主免疫系统。且MgrR 抑制LPS 修饰酶EptB 的翻译，微调LPS 结构。此外eptB mRNA 也被sRNA ArcZ 抑制[33]。sRNA GcvB和MicA 与phoP mRNA 碱基配对抑制其翻译。然而这种GcvB 介导的phoP mRNA 翻译抑制对MgrR 没有影响[34]。几种sRNA 共同调节LPS 组成并促进其结构多样性。

细菌胞外被膜作为最外层保护性屏障，最先感应外界环境的变化，也最易受不良环境影响，造成外膜损伤。大肠杆菌在环境压力下进化出一系列sRNA 参与的调控方式以修复损伤的胞外被膜并维持其完整性，至少包括3 种胞外被膜应激反应（Envelope stress responses，ESR）调控途径，通过单一或协同作用以维持胞外被膜的动态平衡（Homeostasis），分别为RpoE、Cpx 和Rcs 途径[35]，其中σE和Cpx 信号传导途径高度互联。

大肠杆菌RpoE（σE）胞外被膜应激反应对外膜的监测和修复是革兰氏阴性菌的核心功能，由σE介导的胞外被膜应激反应由大约100 个基因组成的单层激活网络。σE 作为RNA 聚合酶的组分，可以激活转录但不能直接抑制基因表达。在非应激条件下，σE 被负调节剂RseA 以非活性形式隔离在内膜中。当DegS 响应外膜（OM）损伤、错误折叠或未折叠外膜蛋白（OMPs）的累积刺激时，RseA 裂解被蛋白水解后释放σE 到胞质中，指导RNA 聚合酶转录激活σE 调节因子。调节剂RseB 可与RseA 结合保护其免受DegS 的裂解[36]。其中sRNA 可以阻止OMP 的合成，直到压力得到缓解。例如RybB 和/或MicA 抑制所有主要的OMPs，下调所有主要OMPs 的转录物，以减少错误折叠的孔蛋白在周质内的积累，因此可以减少σE 的诱导并有助于恢复胞外被膜的动态平衡[37]。Cpx ESR 调控途径依赖于TCS 双组分系统，其由内膜（IM）组氨酸激酶CpxA 和细胞质反应调节剂CpxR 组成，主要调节IM 和细胞质的稳态。胞外被膜应激存在时，CpxA 充当激酶磷酸化CpxR，使其与同源DNA 序列结合，上调胞外被膜蛋白折叠相关基因的表达以维持胞外被膜稳态[38]。在无应激的情况下，CpxA 使CpxR 去磷酸化并维持在无活性状态[39]。通过微阵列发现CpxR 与sRNA CyaR和RprA 启动子区域结合调节基因的转录表达。而cypR 表达对Cpx 途径产生了连贯的前馈环[40]，RprA以依赖于响应调节因子CpxR 的方式降低Cpx 活性，对Cpx 途径施加负反馈[41]。RprA 的表达与另一个胞外被膜应激反应即Rcs 途径也有关系。在Rcs 系统中，环境信号传递给传感器激酶RcsC，传感器激酶又将磷酸盐转移到反应调节剂RcsB 中。反应调节剂的磷酸化和去磷酸化改变该蛋白质的活性，通常通过调节其结合DNA 的能力充当转录调节剂。Rcs 磷酸化系统对大肠杆菌荚膜多糖基因的转录调节起作用[42]。RcsB 刺激sRNA RprA 的转录，RprA 抑制csgD的翻译。因此RprA 起到平衡curli/纤维素和荚膜异多糖的作用[43]。虽然curli 在生长的BF 中对细菌细胞的有效粘附是必需的，但是大量合成的表面暴露的curli 菌毛可能对胞外被膜应激有害[16]。因此这3 种途径对维持细胞胞外被膜的稳态发挥了重要的作用，使细菌能更好的应对环境压力。

2.4 调控铁代谢 铁是细菌代谢最重要的金属之一，在多种酶反应中起辅助因子的作用，在电子转运，TCA 循环和DNA 合成等几种代谢过程中也必不可少，维持铁稳态对所有微生物至关重要，但过多的游离铁对细菌有毒性[44]。铁稳态的调节主要由铁结合转录因子（例如Fur、Dtx、IdeR）和sRNA 介导[44]。RyhB 是由Fur 调控的非编码sRNA，其主要作用是通过（i）抑制编码铁利用蛋白（iron-using）mRNA 的表达；（ii）与转录调控因子IscR 一起，通过调节管家Isc 机制和erpA（Fe-S 生物发生效应物）表达来协调Fe-S 生物发生（Fe-S Biogenesis）系统；（iii）通过shiA和cirA（转运蛋白，铁载体生产的前体）的上调促进铁摄取，使细胞应对低铁条件[45]。当细胞内铁水平升高时，Fur 转录调控因子被激活并抑制铁获得基因的转录起始，Fur 抑制RyhB 的表达[44]。相反，当铁水平降低时，Fur 变得不活跃（inactive）且诱导铁获得基因和RyhB 的迅速表达[46]，RyhB 与Hfq 结合，并以反义方式与其靶标mRNA配对阻断翻译，使细胞内铁重新分布[45]。虽然Fur和铁直接调节RyhB，但有证据表明RyhB 本身也影响细胞内游离铁的水平，其表达可导致胞内游离铁浓度增加50%。

2.5 调控毒力基因的表达 致病性调控相关的大肠杆菌sRNA 可通过感受外界环境条件的改变而调控自身毒力基因的表达，有效地促进该菌在宿主体内的存活、增殖和扩散。例如大肠杆菌O157 中一种新的sRNA-Esr055，可感知肠道内的低DNA 浓度，促进该菌在肠道内的优先定植[47]。σ（E）依赖性sRNA RybB 可通过下调生物膜调节因子CsgD 的表达而抑制大肠杆菌BF的形成[48]。sRNAPapR 与大肠杆菌毒力相关，papR 的缺失增强了UPEC 对膀胱和肾细胞系的粘附能力[49]。sRNA DsrA 可影响鼠伤寒沙门氏菌的耐酸性和毒力[50]。

本实验室研究了sRNAMcaS 对大肠杆菌O157∶H7 致病的调控，发现McaS 在大肠杆菌O157∶H7 对宿主细胞的粘附、运动性、群体感应等过程中发挥重要的调节作用，从而影响其致病性。McaS 通过促进多糖粘附素分泌相关的孔蛋白基因pgaA 的表达增强该菌的粘附能力，通过促进鞭毛合成过程的重要转录因子flhD 的表达而增强大肠杆菌O157∶H7 的运动能力，并且通过促进luxS 基因的表达，增强了大肠细菌O157∶H7 的群体感应能力[51]。

sRNA 与靶mRNA 的配对大多需要伴侣蛋白Hfq的参与。Hfq 作为转录后调控的核心成员参与许多致病菌的毒力调控过程，包括细菌的黏附性、耐药性、BF 的形成、运动能力、对外界环境压力反应能力及群体感应等。本实验室研究发现，K88ac+产肠毒素大肠杆菌Hfq 对BF 形成和对细胞的黏附能力至关重要，hfq 基因缺失株形成BF 的能力和对IPEC-J2细胞的黏附能力明显下降，对小鼠毒力及在肠道内定植也明显减弱[52]。

3 展 望

大肠杆菌是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌，特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有致病性。sRNA 对大肠杆菌的调控作用仍有许多不明之处。如在大肠杆菌BF 形成方面，我们目前已知sRNA GcvB、McaS、OmrA/B 和RprA 对csgD 表达产生完全抑制作用，但其确切分子机制还未被完全理解。并且已知诱导σE 或Cpx 系统的突变产生较少的curli，而σS 水平的刺激增加了curli 表达。可以看出curli 纤维的形成是大肠杆菌中独特生活方式的一部分，与关键代谢途径紧密相关，包括核苷酸合成，细胞胞外被膜维持和柠檬酸循环。因此可以深入研究BF 形成与细胞胞外被膜之间的联系，sRNA在中间起到了什么作用？在调节铁稳态中细胞外铁的进入或细胞中已经存在的铁的再分配是怎样的？sRNA 起到什么作用？并且在对外膜的调控方面，由于噬菌体通常使用OMP 作为受体，因此细菌受噬菌体攻击，革兰氏阴性菌通常需要快速调整其OM的组成，调节性sRNA 在这些适应过程中起到什么关键作用值得探索。

sRNA 早已成为国际上新的研究热点。虽然已分离的sRNA 种类较多并不断被人们认知，但大多数sRNA 功能未知，其作用机制及其调控网络研究仍然处于初级阶段。从目前积累的知识分析，原核生物可能借助于这些sRNA 对它们的生理系统进行精细调控，以便适应迅速变化的环境。因此，深入认识这些sRNA 可能开辟一个新的研究领域。