循环肿瘤细胞在肝癌中的应用进展

胡盼 刘莹 咸蕾 王鑫森 李佳睿

(吉林大学第一医院，吉林 长春 130021)

肝癌在恶性肿瘤死亡顺位中仅次于胃癌、食道癌而居第三位〔1〕。尽管针对肝癌已有诸多治疗措施，但由于大多数患者诊断延迟，发现时已达中晚期，导致肝癌患者治疗后的预后较差，而根本原因即是肿瘤的复发与转移〔2〕。目前所能发现的肿瘤转移灶大多数是通过计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)或正电子发射计算机断层显像(PET-CT)等影像检测手段，但此时往往进入了肿瘤晚期。循环肿瘤细胞(CTCs)是指由原发肿瘤或转移灶通过血管侵犯而侵入癌症患者外周血液中的肿瘤细胞〔3〕。早在1869年，Ashworth就在1例乳腺癌患者尸检过程中发现了外周血中存在肿瘤细胞，随着近年来分子生物学及检测技术的发展，CTCs成为肿瘤早期转移及治疗术后复发领域研究的热点〔4,5〕。已知，CTCs在乳腺癌、肺癌、前列腺癌及结直肠癌复发及预后的预测中起着重要作用，但其在肝癌中的研究应用还远不及这些肿瘤类型。本文着重探讨肝癌CTCs的检测及其对肝癌复发及转移的预测作用。

1 CTCs的富集

对于CTCs来说，从原发灶或转移灶的释放率尚未得知，已有实验模型表明〔6〕，数以百万计的肿瘤细胞将会被释放到血液循环中，但最终仅仅有数量相当少的细胞可以成功地转移到远处器官，逃避宿主免疫，保持休眠状态，待锚定器官微环境适合时侵入，形成肉眼可见的转移病灶。究其原因〔7〕，首先，大量的血细胞及血流造成的剪切力会显著减少CTCs的数量；其次，宿主的自身免疫系统也会检测到一部分肿瘤细胞，并将其清除；最后，肿瘤细胞若在血流中存活，还必须逃避失巢凋亡的过程。综上，外周血液中CTCs的数量十分有限，通常每106～107个血细胞中，只能找到一个CTCs。因此，CTCs富集技术的灵敏度和特异性也是成功检测CTCs的关键。CTCs的富集策略可按照依赖其物理特性和生物特性分为两大类，前者主要是根据CTCs的密度、体积、形状等有别于其他血液细胞的特点而将其分离，后者主要是根据CTCs的表面存在诸多特异性的抗原，利用抗原-抗体反应将其富集。

1.1密度梯度离心法 此方法是根据各种细胞在血液中的密度存在差异，通过离心的方法，将CTCs滤出。通过离心，红细胞、中性粒细胞及单核细胞被分离至不同层面，肿瘤细胞位于最上层。目前常用的细胞密度梯度介质为Ficoll和Onco Quick，有研究报道〔8〕，后者较前者具有更高的灵敏度。密度梯度离心法具有便捷、廉价、易操作，且不会破坏细胞结构等优点，但其灵敏度较低，容易掺杂其他细胞，也容易造成CTCs的丢失，形成假阴性的结果，因此在实际应用过程中，此方法常常作为检测CTCs的前期工作基础。

1.2滤过分离法 滤过法以CTCs的直径大于其他血液细胞为依据，而实现CTCs的富集。Vona等〔9〕发明了上皮肿瘤细胞大小分离(ISET)方法，通过聚碳酸酯膜来过滤血液，使得CTCs与血液中的其他细胞分离。该种方法与密度梯度离心法类似，因此只作为前期步骤。

1.3免疫磁珠分离法 免疫磁珠分离法的基本原理为：将细胞表面相关抗原的抗体包被于具有顺磁性的磁珠表面，这样磁珠就会通过“磁珠/抗体-抗原/细胞”与细胞结合，外加强大磁场，目标细胞就会与其他细胞分离。基于此原理，免疫磁珠分离法可以分为阳性分离法和阴性分离法。阳性分离法是将磁珠与CTCs表面抗原结合而直接分离CTCs的过程，而阴性分离法是将磁珠与血液细胞表面抗原结合而间接分离CTCs的过程，例如白细胞表面的特异性CD45抗体。阳性分离法具有代表性的方法被美国FDA批准用于临床的Cell Search系统，Cell Search系统检测的原理是基于大部分实体肿瘤细胞表面均表达上皮细胞黏附分子(EpCAM)抗原，以此为靶点进行富集CTCs〔10～13〕。肝癌虽然为上皮起源的肿瘤，但由于其向远处侵袭过程中会发生上皮间质转化(EMT)，相应的上皮细胞表面抗原也会向间质细胞表面抗原转化，因此肝癌细胞表面的上皮细胞标志物EpCAM表达水平相对较低〔14,15〕，该系统并不适用于肝细胞肝癌CTCs的监测。Xu等〔16〕利用去唾液酸糖蛋白受体的特异性配体来包裹磁珠，成功地从85例肝细胞癌患者中检测出69名CTCs阳性患者，而在健康体检者、良性肝脏肿瘤以及非肝细胞性肝癌患者中未检测出CTCs。

1.4Can Patrol系统 最近，由我国自主开发的Can Patrol系统检测肝细胞肝癌患者CTCs弥补了肝细胞肝癌研究领域的不足，该系统通过有机结合纳米技术和多重RNA原位分析(RNA-ISH)技术，对CTC的分离不依赖于特定生物标志物，大大提高了CTCs的回收率〔17〕。此外，与Cell research为代表的一代CTCs富集技术相比，Can Patrol系统不仅克服了Cell research技术只能分离获得某一特定表型CTCs的缺陷，同时完全实现了对所有肿瘤表型CTCs的分离与鉴定〔18,19〕。

2 CTCs的识别

2.1形态分析与免疫组化 Cell Search系统将≥4 μm、DAPI+、角化蛋白(pan-keratin)+及CD45-的细胞判定为CTCs。Nam等〔20〕应用细胞团块联合多重免疫组化的方法，检测了肌酸激酶(CK)、EpCAM、上皮细胞膜抗原(EMA)、重组人细胞角蛋白(CK)18、肝细胞单克隆抗体(HepPar)-1、磷脂酰肌醇蛋白聚糖(Glypican)-3及甲胎蛋白(AFP)，29例肝癌患者检出率为48.3%，但是CK、EpCAM、Gypican3及AFP阳性的CTCs大部分存在于具有上皮细胞特征的肝癌细胞系中，对于发生EMT的肝癌细胞，可能会有遗漏。由于肝癌在侵袭过程中的异质性，很难确定肝癌CTCs的特异性标志物，因此，这也是此种方法的局限性所在。

2.2特异性核酸分析法 特异性核酸分析法并不是直接找到肿瘤细胞，而是通过在外周血中找出肿瘤细胞的特异性核酸，而间接证实CTCs的存在。因此，核酸表达的特异性直接反映了此方法的可靠性。因为肝癌细胞与正常的上皮细胞有着相同的EpCAM，所以，大大降低了依赖于EpCAM分离CTCs的特异性，Jin等〔21〕通过在EpCAM免疫磁珠技术分选后的CTCs中检测AFP mRNA的水平，提高了CTCs检测的灵敏性及特异性。但是，由于血流中存在游离的肿瘤细胞DNA，此种方法很有可能形成假阳性的结果。

3 CTCs与肝癌

3.1CTCs与肝癌的治疗 肝癌的治疗手段颇多，手术切除、肝移植、肝动脉化疗栓塞术(TACE)、射频消融术(RFA)、微波消融术(MWA)、放疗等。Fang等〔22〕利用EpCAM免疫磁珠法检测TACE围术期患者外周血及右心房血中CTCs的数量，结果表明两组患者TACE术前与术后相比均无统计学差异，而右心房中的CTCs要多于外周血。Sun等〔23〕通过检测123名行手术切除的肝细胞癌患者术前及术后1个月的CTCs发现，术前7.5 ml血液中CTCs≥2个的患者要比CTCs<2个的患者复发早，并且CTCs≥2个是肿瘤复发的独立预测因子。

3.2CTCs与肝癌的预后 血行转移是肝癌常见的转移形式，因此肝癌患者血液中的CTCs与其预后有直接关系。CTCs与患者的总生存期、无进展生存期、肿瘤分期等相关联。Schulze等〔24〕发现，EpCAM+的CTCs阳性患者总生存期(OS)较CTCs阴性患者短，且与巴塞罗那(BCLC)分期呈正相关，提示CTCs阳性影响肝癌患者的预后。Nel等〔25〕通过对行选择性内放射治疗(SIRT)的肝癌患者CTCs进行检测，报道胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)-1 mRNA的水平与进展时间(TTP)相关，认为CTCs可以作为肝癌患者个体化治疗的新型分子标志物。Chen等〔26〕回顾分析了195位肝细胞癌患者的CTCs水平及分型得出结论，总CTCs数量与BCLC分期、转移及血清AFP水平相关，并且复发的患者含有更高混合型CTCs和间质型CTCs，表明CTCs的数量和EMT的分型与肝癌的预后存在关联。

4 总结与展望

肝癌的转移起始于原发灶内的肿瘤细胞扩散到血液中，随后等待时机，侵袭远处器官形成转移。随着科学的发展，释放入血的CTCs已经可以被有效富集和检测，但由于肝癌的异质性及在转移过程中EMT的发生，导致肝癌CTCs的检测方法尚未形成共识。而由于检测方法不一，致使各位学者对CTCs在肝癌的治疗及预后方面的看法也有少许出入。因此肝癌CTCs检测技术的改进和完善及如何将其应用于临床实际工作中，将仍然是未来的热点话题。希望基础医学、临床医学和转化医学的研究者能够更加深入的探索CTCs的相关知识，并最终改善患者预后，为肝癌的诊治提供新方法、新策略。