STZ制备糖尿病大鼠模型影响因素的研究进展

韩旭,王璇,余芝,徐斌

(南京中医药大学针药结合教育部重点实验室,南京 210023)

2019年,国际糖尿病(diabetes mellitus,DM)联合会发布数据显示:2019年全球DM患病率为9.3%,2030年将上升到10.2%,2045年将上升到10.9%[1]。迫切需要更优的诊疗方案来对抗DM,而临床前模拟人类DM的动物模型至关重要。相比基因动物,化学药物损伤胰岛功能诱导DM操作简单、成本低、应用更广泛[2]。常用试剂是链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)和四氧嘧啶(alloxan,ALX),ALX在1943年首次用来诱导DM[3],它通过氧化应激破坏胰腺β细胞,但和STZ比,有效性低、副作用大,会引起肝、肾毒性,故应用较少[4]。STZ最初是在1960年从不产色链霉菌中分离出来的,是一种亚硝基脲类似物,其DM致病性到1963年被报道[5],STZ对胰岛β细胞有高度选择性破坏作用,通过葡萄糖转运蛋白2进入β细胞,其细胞内作用导致DNA改变,β细胞死亡的主要原因是DNA烷基化,一氧化氮和活性氧的协同作用也可能导致STZ引起DNA断裂和其他有害变化。DNA损伤激活多聚ADP核糖基化,导致细胞烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和三磷酸腺苷的耗竭,蛋白质合成减少,β细胞死亡[4,6]。STZ对其他组织器官毒性相对较小,造模成功率高,是国内外应用最广泛的DM模型化学诱导剂[7]。但具体应用方法各文献报道不一,本文就STZ诱导的DM大鼠模型探讨可能对模型产生影响的要素,以期对今后DM大鼠模型的制备有所裨益。

1 动物选择

小鼠、大鼠、猪和猴子等对STZ敏感,兔不那么敏感[8],大鼠和小鼠较常用[9]。应用最多的是大鼠,体积小、生命周期短、来源广泛、经济、坏境及遗传因素易控制,是较理想的选择,对于品系常使用SD或Wistar大鼠[4,10]。农慧等[10]使用同条件STZ,Wistar大鼠死亡率>50%,SD大鼠抵抗力强于Wistar大鼠,推荐SD大鼠。且不同等级SD大鼠亦有差别,普通级死亡率>50%,SPF级死亡率仅2.17%。郭学军等[11-12]研究显示Wistar大鼠的成模率和死亡率均高于SD大鼠,推测Wistar大鼠敏感性强于SD大鼠,抵抗力弱于SD大鼠。

1.1 大鼠性别

STZ作用效果与大鼠性别相关,雄性比雌性更敏感[13-14]。Ostenson等[15]用STZ诱导雄性和雌性新生大鼠2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM),两者的β细胞损伤参数无差异,但成年后雄性比雌性大鼠DM更严重,并证实了这种性别差异是雄激素依赖性的。Cortright等[16]研究显示,和雌性相比,雄性大鼠在线性生长和身体成分改变方面更受STZ影响。李莉等[17]采用同条件STZ,雌性和雄性大鼠成模率分别为26.7%和46.7%。蒋升等[18]观察了STZ诱导DM大鼠的血糖变化,雄性大鼠2周后血糖趋于稳定,雌性大鼠4周后趋于稳定。故除必须使用雌性的模型,建议选用雄性大鼠。

1.2 大鼠体重

陈静等[19]研究显示180～240 g大鼠成模率较高,随体重增加,成模率降低,死亡率增大。张新兰等[20]结合成模率和死亡率考虑,220～260 g大鼠最适合。黄琛等[21]结果显示201～240 g大鼠成模率最高。后两项研究均表示随体重增加,死亡率逐渐降低。章成昌等[22]采用高糖高脂饮食联合STZ诱导T2DM,体重在(240±5)g的大鼠成模率高,胰岛素水平接近正常对照组,体重高于此范围的成模率低,胰岛素水平偏低。综上建议选用体重在220～240 g的大鼠。

1.3 大鼠年龄

Wang等[23]探究了STZ对6～23周龄大鼠的毒性作用,发现STZ注射1周内动物的急性死亡率和年龄成反比,为降低死亡率应选择周龄<12周的大鼠,如需更年长的动物,应考虑降低剂量。大鼠β细胞数量增加能力随年龄减弱,当年龄>1岁后似乎没有这种能力,故不同年龄段大鼠对同剂量STZ的反应不同。高脂饮食(high fat diet,HFD)联合STZ的T2DM模型多使用4～12周的大鼠,8周最常用[24]。STZ联合烟酰胺(nicotinamide,NA)的T2DM模型常用6～12周的大鼠,较年轻的大鼠对STZ的敏感性低,可以被NA更好的保护[4]。使用STZ诱导1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)较常用8～10周的大鼠[25]。陈玥等[26]汇总了常用实验动物和人类年龄相关性理论及计算方式,制成人类年和动物日匹配表,可以根据研究目的参考选择适合日龄的大鼠。

2 实验方案及操作

2.1 STZ注射前禁食时间

STZ分子含有一个高度活性葡萄糖侧链,β细胞会对其错误识别,毒性基因随即带入细胞内,如果注射前或中给予含葡萄糖的物质或类似物,会与STZ竞争性的和β细胞结合,影响STZ发挥毒性作用,故注射前动物应充分禁食[27-28]。有研究探究了禁食对成模的影响,黄琛波等[29]结果显示非空腹组成模率为60%,空腹组为66.7%。黄琛等[21]结果显示正常饮食组成模率33.3%,禁食组成模率66.6%。叶桐江等[30]观察了STZ注射前禁食12、16、20、24 h的造模情况,随禁食时间的延长,造模率逐渐增高,但当超过20 h,成模率无明显上升,死亡率大幅增高,故建议20 h为最佳禁食时间。

2.2 STZ剂量

STZ用量主要取决于想要模拟DM的类型及严重程度[14]。通常参考已发表文献,但即使同一品系动物来自不同供应商也存在差异,建议先进行预实验确定所用剂量。从造模成功率、死亡率、缓解率综合评判,以成模率高、病死率低、缓解率低为最佳剂量[7]。STZ价格较昂贵,卢慧等[31]通过建立数学模型描述制作DM大鼠模型的成本,根据对血糖值及病程的要求计算出STZ剂量和大鼠体重的最优组合,但其仅考虑了死亡率和未成模率,未把发病机理的因素纳入。本文根据STZ注射剂量和次数分为:大剂量单次、小剂量单次和小剂量多次。

2.2.1 大剂量单次

大剂量单次多用于诱导T1DM,损伤胰岛导致胰岛素分泌绝对减少而血糖增高。熊煜欣等[32]设置了20～60 mg/kg梯度剂量组,STZ注射5 d后,20、30 mg/kg组血糖依旧在正常范围,说明此剂量不足以引起足够的β细胞损害,另外3组均出现高血糖,50、60 mg/kg组成模率均为100%。高鑫等[28]对不同剂量STZ比较发现,剂量越小转阴率越高,不应<40 mg/kg。黄琛等[21,33]比较了40、50、60 mg/kg STZ的造模情况,50 mg/kg最佳。叶桐江等[30]比较了50、60、70 mg/kg STZ,成模率均较高,死亡率随剂量增加成倍增加,故推荐50 mg/kg。李钊至等[34]建议剂量在40～50 mg/kg最合适,45 mg/kg有较高的成模率和较低的死亡率。郭延敏[35]设置了55～70 mg/kg梯度剂量,65 mg/kg成模率较高、死亡率低,与以上研究差异较大,可能是成模标准定的过高。综上建议STZ诱导T1DM单次注射剂量45～50 mg/kg。

大剂量单次诱导T2DM,使用STZ联合NA,NA是维生素B3的酰胺形式,利于细胞内DNA修复、维持烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水平,对胰岛β细胞化学性与免疫性损伤有明显的防护作用[9,36]。NA对STZ的DM效应起保护作用,STZ联合NA是一种非胰岛素抵抗、胰岛素缺乏的T2DM模型[9]。Masiello等[37]比较了100～350 mg/kg范围内4个浓度的NA,结果显示230 mg/kg NA结合65 mg/kg STZ致约60%的β细胞功能丧失,产生稳定、中度高血糖。Furman等[9]重复了上述方案,结果显示75%～80%的大鼠出现中度高血糖。此方法主要变量是NA剂量(60～290 mg/kg)、STZ剂量(45～65 mg/kg)和间隔时间(普遍15 min)。翁琰等[38]设置了100～200 mg/kg不同剂量NA联合65 mg/kg STZ造模,120 mg/kg组成模率为80%,无死亡,为最优剂量。

2.2.2 小剂量单次

小剂量单次多用于诱导T2DM。T2DM多发于成年,遗传易感性固然存在,但营养过剩、生活习惯不良等导致的超重、肥胖在病程中起重要作用[39]。DM前期患者通常会存在以高胰岛素血症、胰岛素抵抗和血脂异常为特征的肥胖状态[24,40]。肥胖是T2DM发展最常见的危险因素[41]。T2DM早期以糖脂代谢紊乱及胰岛素抵抗为主,晚期以胰岛素相对缺乏为主,理想的模型应具备以上特点[42-44]。HFD可以引起糖脂代谢紊乱,通过糖脂肪酸循环、胰岛素信号转导等途径降低胰岛素敏感性[44]。单纯HFD可以诱导DM,短期内可引起胰岛素抵抗和/或葡萄糖耐受不良,但要使血糖升高需更长时间(>10周)[4]。早期代偿机制(β细胞的数量增加或功能增强)可以维持血糖正常,这时如给予小剂量STZ辅助部分破坏β细胞,机体失去了足够的代偿能力,短期内即可造模成功[24,45]。

HFD的成分和喂养时间都会影响体重增加和脂肪分布,本文主要探讨喂养时间,短期往往会诱发胰岛素抵抗和/或葡萄糖耐受不良,相对长期(5周)会导致更高的体脂率,发展肥胖症要更长时间(>3个月),可以根据需要模拟的DM前期状态选择喂养时间[24]。HFD喂养时间的长短和胰岛素抵抗程度、血脂异常程度正相关,和STZ用量负相关,但考虑到动物生命周期、慢性并发症的发展及后续实验,建议8周为宜[46-48]。陆少君等[49]比较了4周和8周HFD的造模差异,发现8周动物生存状态差,4周更佳,减少了死亡率,缩短实验周期和成本。T2DM典型特征包括胰岛素抵抗和胰岛功能受损,桑延霞等[50]研究显示,高热量饮食仅能诱导约50%的大鼠产生胰岛素抵抗,因此诱导后需先测量空腹胰岛素,筛选胰岛素抵抗大鼠,淘汰肥胖抵抗大鼠,保留肥胖大鼠,再行STZ,使病理机制保持一致。少有报道STZ给药前高胰岛素血症、肥胖症、葡萄糖耐量降低等数据,它们代表DM前期状态,可以反映模型这一阶段的病理类型[24]。

小剂量单次的用量要区分于T1DM,即单独使用不能致高血糖,小部分破坏胰岛细胞,又保证一定的成模率[48]。杨架林等[51]研究显示,同用25 mg/kg,只有在HFD后才能引起高血糖,普通饲料喂养不能引起高血糖,因为动物本身没有胰岛素抵抗,β细胞对于小损伤还可以代偿。2周HFD后,Islam等[52]分组给予30、40、50 mg/kg STZ,发现40 mg/kg组更符合T2DM的特点;徐文平[53]进行了40、45、50 mg/kg的剂量比较,45 mg/kg成模率最高,无死亡。4周HFD后,李柱云等[54]比较了30、40、50 mg/kg STZ的造模情况,结果显示40 mg/kg组具有T2DM的主要特征,成模率最高,死亡率较高剂量低,稳定性较低剂量好。肖艳红等[55]比较了15～45 mg/kg STZ,35 mg/kg最佳。陆少君等[49]比较35、40 mg/kg STZ造模,成模率相同但40 mg/kg死亡率较高。邵俊伟等[56]采用35 mg/kg STZ,除因注射不当未成模外,其余均成模,无死亡,建议剂量在30～40 mg/kg。章成昌等[22]采用35 mg/kg STZ,成模率93%,无死亡。8周HFD后,何清华等[57]注射STZ 30 mg/kg,成模率100%,无死亡。同剂量魏占英等[58]成模率80%,死亡率30%,优于其他方案。周迎生等[59]建议HFD喂养4～8周后,以25～40 mg/kg STZ为宜。张汝学等[60]采用3个月HFD加30 mg/kg STZ,模型成功后如停用HFD,空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)会在5～7 d后恢复正常,建议成模后最好维持HFD。综上,HFD喂养时间越长,胰岛素抵抗越明显,需要STZ的量越少。

2.2.3 小剂量多次

刘霆等[61]应用STZ诱导T1DM,30 mg/kg每周1次,连续4周,观察到STZ诱导胰岛损伤有量效和时效关系,即逐渐加重胰岛损伤。大多数T1DM患者由于自身免疫系统紊乱,β细胞被严重破坏,胰岛素分泌绝对不足而导致血糖升高,是一个自身免疫系统参与的渐进过程。小剂量多次可以不断激活自身免疫反应,破坏免疫机制,最终出现稳定持久的DM。和大剂量单次比,能更好的模拟T1DM的发病过程,降低死亡率,不过造模周期较长。曾新生等[62]认为一次性大量破坏胰腺β细胞使动物迅速达到过高的FBG(>20 mmol/L),不能很好的模拟T1DM,其采用30或40 mg/kg隔天注射3次,期间喂养1%葡萄糖水,成模率较高。孟召祥等[63]采用35 mg/kg每周1次,连续4周,成模率91%,无死亡。

亦有HFD结合小剂量多次注射STZ的造模研究。林心君等[64]在4周HFD后,2次注射STZ,对注射的间隔时间和用量进行探索,证实以25 mg/kg间隔2 d最佳,剂量计算使用体重联合表面积的算法,因当大鼠>300 g时,单纯以体重计算导致2/3大鼠死亡。此方案成模率高,无死亡,8周后无自愈。Zhang等[65]等认为小剂量多次注射可能会引起毒性反应和免疫反应的结合,逐渐引发高血糖,4周HFD后,每周注射1次,连续2周,25 mg/kg成功率25%,30 mg/kg成功率85%。林燕超等[46]在8周HFD后,连续2 d注射20 mg/kg STZ,优于单次注射20或30 mg/kg组。但小剂量多次工作量大,总误差大,增加动物感染率。

大剂量单次广泛用于T1DM的药物实验,小剂量多次主要用于探讨胰岛坏死及增殖机制的研究[66]。农慧等[10]认为关于DM并发症的研究,因T1DM和T2DM的病理改变基本相同,所以可采用大剂量单次注射,缩短造模周期。对于妊娠DM模型,STZ的用量从25～65 mg/kg不等,由于增加了胚胎因素,要根据具体研究目的,结合成模率、母鼠死亡率、子鼠生长状况等因素综合考虑[67]。López等[68]研究表明,在大鼠妊娠第6天,注射35 mg/kg STZ可以模拟不受控制的或中度的妊娠期DM的大多数病理变化。

2.3 STZ的配置

STZ粉末-20℃避光保存,其溶液极不稳定,需现配现用,冰浴避光操作,缓冲液使用柠檬酸或枸缘酸缓冲液(pH=4.2～ 4.5),提前预冷[24,34,46,69-70]。尽管STZ在缓冲液中具有最大稳定性,但短时间内仍会降解,配置后要在一定时间内尽快用完,文献报道不一:5[9,71]、10[72]、15[70]、20[73]、30 min[30,33,49]内,最好分多次配置,保险起见在溶解后5 min内用完。

2.4 STZ给药途径

STZ可以通过静脉、皮下、腹腔给药。黄波等[29]比较了空腹腹腔注射和尾静脉注射的差异,后者成模率93.3%,远大于腹腔注射组,推测可能与药物的吸收更直接有关。也有研究表明两种方式的成模率相当[60,74]。尾静脉较细,不易操作,易造成药物损耗,不好控制速度,故常选择腹腔注射[75-76]。注射前提起腹壁30°进针,进针前先回抽,不要误入皮下或脏器[77]。最好注射在腹部同侧,保持操作一致性,利于血糖的均一稳定[56]。

2.5 STZ注射后的护理

注射后给予动物充足的水和食物,胰岛细胞坏死和胰岛素的突然释放,会导致致命的低血糖,为避免在6～12 h的低血糖期出现死亡,可以在给药后向动物提供10%的蔗糖水或葡萄糖水[9,28]。大鼠很快会出现多饮、多食、多尿的症状,要保证充足的供水量,及时更换垫料,保持鼠笼干燥清洁[73]。动物如出现无法进食、饮水、站立、体温过低等虚弱或濒死状态,应遵守相关动物实验伦理规则,执行安乐死,最大程度减少动物的痛苦[78]。

2.6 血糖测量

血糖测量最好在麻醉状态下进行,束缚应激可致大鼠血糖升高[79]。可眼眶采血或断尾采血,但伤害较大,如测量较频繁,可用尾静脉采血[73,80]。采血前注意清洁消毒,避免杂质影响测量结果,结束后止血以免感染[81]。需要注意的是,当用葡萄糖作为DM诊断时,可使用全血、血清或血浆,推荐通过标准化酶法使用静脉血浆测量[82]。血糖精确的目标是变异系数≤2.2%,在诊断人类DM时不推荐使用测量全血的便携式血糖仪,它们精度及重复性差且不同仪器存在差异,还没有血糖仪达到美国DM协会设定的分析误差<5%的目标。优点是使用方便、创伤小[83]。人类测量FBG需禁食≥8 h,李莉等[17]提出20:00是大鼠进食高峰期,10:00至12:00进食基本完成,此时禁食类似人类晚饭后禁食,晚12:00至晨8:00禁食更合理。Furman等[9]认为老鼠在夜间进食,测血糖前一夜的禁食实际上禁食了24 h,可能引起影响血糖读数的一些生理反应,可以在7:00至15:00点禁食。

3 成模判断标准

DM模型的判定标准不一,血糖、尿糖、葡萄糖耐量、胰岛素或C肽水平、胰腺组织形态学等都可以评价,最基础的是血糖,但不同物种血糖浓度不同,因此人类DM定义不一定适于动物[84]。一般,STZ诱导的大鼠非空腹血糖水平>200 mg/dL(11.1 mmol/L),FBG>150 mg/dL(8.3 mmol/L)[9]。农慧等[10]认为DM大鼠不耐饥饿,夜间活动量大,禁食>12 h易造成血糖过低而死亡,不推荐使用FBG,使用随机血糖操作性更强。STZ注射后的血糖变化表现为急性3期反应:(1)早期高血糖(2～4 h):肝糖原分解,胰岛素释放受到抑制;(2)低血糖(6～10 h):胰岛β细胞被破坏,胰岛素大量释放;(3)稳定高血糖(24 h后):胰岛β细胞呈现不同程度的损伤,胰岛素含量下降[4]。故多数研究在至少72 h后测量血糖。

胰腺受损后胰腺导管中干细胞可以分化成胰岛细胞,即胰岛功能的自行缓解[85-87]。高鑫等[28]表明在10 d内自然缓解率较高,最好成模10 d后再做实验,减少自愈的干扰。邵俊伟等[56]研究显示FBG在1周后达高峰,2周基本稳定,推测其和STZ引起的慢性炎症、自身免疫系统机制相关。张巨彪等[72]建议在建模后3、7、14 d测血糖,14 d的血糖依然稳定者纳入实验。魏占英等[58]研究显示STZ注射9 d后,FBG≥20 mmol/L的大鼠血糖始终维持较高的水平,反映内源性胰岛素分泌功能较差;FBG<10 mmol/L大鼠的血糖随后会出现一定程度的下降;FBG处于10～19.9 mmol/L的稳定性好,更适合T2DM的研究。FBG在10 d内波动,17 d后基本稳定[88]。汪峰等[89]诱导T1DM模型发现自愈都发生在STZ注射3周内,3周后趋于稳定且长期维持,建议至少连续3周监测,确保模型质量。魏泽宁[90]等建立T1DM模型,对于单次给药未成模的大鼠,1周后给予同剂量STZ补救,补救组均成模且和首次成模组血糖值无统计学差异,但在组织器官上的差异未探究。对于血糖过高(>30 mmol/L)的大鼠,在不影响实验的前提下,可给予胰岛素适当维持生命周期[30,77]。

大鼠DM诊断尚未标准化,但有3点共识:(1)同一实验中对照组和造模组采用同一方法测血糖,即动物均处于空腹或非空腹状态;(2)同一实验不同时使用FBG和非空腹血糖来判定;(3)高血糖被定义为模型组的血糖明显高于对照组,有统计学意义[9]。对于T2DM,高胰岛素—正常血糖钳夹术是测定胰岛素敏感性的金标准方法[91]。糖耐量、胰岛素耐受程度、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)等可进一步评价模型的胰岛素分泌能力和组织对胰岛素的敏感性[92]。

4 其他因素

周卫民等[93]探究了光照对STZ诱导的大鼠模型的影响,光照可能会影响动物的内分泌和饮食,动物房内笼架的设置和顶部照明很难保证动物接收同等光照,离光源近、光照较强处,大鼠成模率较低,反之越高,但对模型的稳定性影响不大,提示光照也是一个影响因素。某些未知的环境条件和刺激可能会增加STZ诱导DM的变异性,应尽量保证动物处在均一的条件下[14]。

5 结语

STZ诱导造模是较理想且实用的DM造模方法,其缺点是价格昂贵,以非常快速、不自然的方式诱发DM,因此上述任何方案都无法精准地模拟人类DM[24]。模型的长度取决于研究目的,从几天的急性研究到数周的并发症研究,对于并发症研究,还应考虑如何保证动物的存活时间[12]。T2DM模型成模后最好继续维持HFD[94],或者后续再次注射STZ来维持模型稳定[9]。目前DM动物模型分类较简单,临床上分类更加细致,如根据T2DM的持续时间和严重程度分为:FBG受损型、糖耐量受损型,再考虑到体脂、炎症因素等分型,STZ诱导的DM大鼠模型能否有更细致的分类有待研究[12,24]。