猪肠道病原研究新平台：新型猪肠道3D 类器官在病原感染与免疫应答研究中的应用

肠道类器官培养系统于2009 年由荷兰胡布勒支研究所（Hubrecht Institute）Hans Clevers 研究员及其团队建立。与传统的原代细胞培养不同，肠道类器官是由分离自肠隐窝的Lgr5+干细胞在富含层黏连蛋白的基质胶中经Noggin、R-spondin I、EGF、Wnt3a等因子刺激分化成具有多种表型的肠道上皮细胞3D研究模型。与细胞系相似，肠道类器官可以传代、冻存，是肠道病原体外感染与免疫应答研究的理想模型。作为一种可反应肠黏膜上皮生理特性和结构的模型，肠道类器官的出现填补了肠道相关研究中细胞系及原代细胞和本体动物模型之间的空白。

目前，肠道类器官已经应用于少量肠道病毒研究中。然而，由于当前3D 培养条件下肠道类器官中肠上皮细胞微绒毛完全内置于球体内部，这使得大多数利用肠绒毛顶端膜入侵机体的病原微生物难以感染该类器官，从而使得相关病原-宿主相互作用的研究难以开展。有研究人员在病毒感染实验中通过物理性破坏类器官整体结构、显微注射、3D 类器官2D 化等手段来建立感染，但这些方法均存在较大缺陷。破坏类器官的物理结构对细胞损伤较大，显微注射费时且进度缓慢，类器官2D 化对细胞量的消耗大且其结果有别于正常生理状态下的真实结果。

近期在《Journal of Virology》发表了“Next-generation porcine intestinal organoids: an apical-out organoid model for swine enteric virus infection and immune response investigations”的研究论文。该研究对猪肠道类器官进行了改造，建立了绒毛外翻型猪肠道类器官体外培养系统，该系统的建立从根本上克服了上述弊端。在该研究过程中，作者首先建立了传统的猪肠道类器官培养系统。此后去除培养体系中的基质胶，并将其置于低黏附性的组织细胞培养板中诱导，培养3 d 后，经形态学观察、间接免疫荧光染色可见悬浮培养的类器官中肠道上皮细胞极性发生翻转。随后，作者鉴定了在传统类器官和极性翻转类器官中均存在主要的肠上皮细胞类型：杯状细胞、潘氏细胞、肠内分泌细胞和肠道干细胞。该研究开发的新型类器官培养方法使猪肠道类器官实现可悬浮培养，该悬浮培养的肠道类器官中肠上皮细胞的极性发生翻转，使得原本位于类器官腔体内的肠上皮细胞顶端膜发生翻转、暴露于类器官外表面。该培养模型更加便于各类病原微生物与肠绒毛上皮相互作用，也更好的模拟了肠道内病原与宿主相互作用的实际情况。

随后，作者采用一种常见的猪肠道病毒——传染性胃肠炎病毒（TGEV）测试了该极性翻转类器官在病原感染与免疫应答中的应用。结果显示，TGEV 可成功感染极性翻转的肠道类器官，此外，TGEV 感染也顺利激活了极性翻转肠道类器官中I 型和III 型干扰素以及炎症免疫应答等通路。

本项研究结果表明，通过优化猪3D 肠道类器官的培养条件，可改变类器官中上皮细胞的极性，以使得肠道3D 类器官中上皮细胞顶端膜直接暴露于外表面从而实现与病原自由互作。此外，该培养体系可是肠道3D 类器官结构仍保持完整、生理特征稳定。该研究为猪肠道3D 类器官更好地应用于肠道病原-宿主互作研究提供了全新的解决方案。