J 亚群禽白血病病毒囊膜表面蛋白受体结合域鉴定

禽白血病是由禽白血病病毒（ALV）引起的一种具有传染性的禽类肿瘤性疾病。J 亚群ALV（ALV-J）自1999 年在我国发现以来，对我国白羽肉鸡、蛋用型鸡、黄羽鸡（我国地方品种鸡）造成严重危害，给我国养禽业造成了巨大经济损失，同时也严重威胁我国家禽种源安全。ALV-J 通过其囊膜表面蛋白（gp85）与细胞受体chNHE1 的特异性结合启动感染，而这种结合能力的强弱，可直接影响病毒侵入宿主细胞的水平，同时病毒侵入机制的阐明为研究抗病新技术也非常重要。我们前期的研究已证明，chNHE1 的第一个膜外环的A28～E39 位氨基酸是受体的最小功能域，其与gp85 蛋白直接结合，介导病毒进入，但gp85 蛋白如何与受体结合，哪些区域或氨基酸参与受体的结合，还不清楚。

近期在《Journal of Virology》发表了“The bipartite sequence motif in the N- and C-terminal of gp85 of Subgroup J avian leukosis virus plays a crucial role in receptor-binding and viral entry”的研究论文。该研究鉴定出ALV-J gp85的N端38-131氨基酸和C端的159-283氨基酸是影响gp85 蛋白与chNHE1 结合的关键氨基酸。此外，gp85 的糖基化位点Gly116 和Gly219 和半胱氨酸位点Cys60和Cys197在受体结合和病毒进入中起关键作用。这些发现有助于阐明ALV-J 进入宿主细胞的分子机制，为ALV-J的防控提供了新的抗病毒靶点。

为鉴定ALV-J gp85 蛋白与细胞受体chNHE1 的结合域，该研究首先表达了可溶性的具有生物学活性的gp85 蛋白，利用流式细胞术建立了检测gp85 蛋白与chNHE1结合能力的方法。采用HA标签逐段替换gp85蛋白全序列的策略，构建并表达了33 种嵌合gp85 蛋白。受体结合和固相结合实验结果均表明：HA5-14（aa38-131）和HA18、HA20-31（aa159-283）的替换，显著影响了gp85 蛋白与chNHE1 的结合能力。为了验证这一结果，该研究将纯化的33 种嵌合gp85 蛋白与RCAS（J）-EGFP 标签病毒进行了病毒阻断实验，结果同样表明，HA5-14（aa38-131）和HA18、HA20-31（aa159-283）的替换，导致嵌合gp85 蛋白不能够阻断RCAS（J）EGFP 标签病毒进入靶细胞。综上，gp85 蛋白的第38-131位和159-283位氨基酸是影响ALV-J与受体结合的关键氨基酸区域。

为进一步探究ALV-J gp85蛋白的糖基化位点和半胱氨酸位点对其结合受体结合力的影响，该研究将gp85 蛋白的第38-131 位和159-283 位氨基酸中的糖基化位点和半胱氨酸位点回复突变，然后利用流式细胞术和固相结合证实糖基化位点Gly116和Gly219、半胱氨酸Cys60 和Cys197 影响ALV-J 与受体的结合能力。为进一步验证这2 个糖基化位点和2 个半胱氨酸对ALV-J 与受体结合、进入靶细胞的作用，该研究构建糖基化位点（Gly116 和Gly219）和半胱氨酸（Cys60 和Cys197）突变的4种重组毒（ΔN6，ΔN11，ΔC3和ΔC9）和对应回复突变的4 种重组毒（rN6、rN11、rC3 和rC9）。病毒拯救结果表明，仅回复突变的4 种重组毒rN6、rN11、rC3 和rC9 成功拯救；进入实验结果表明，rN6、rN11、rC3 和rC9 重组病毒能够有效进入DF-1细胞。这些结果表明，ALV-J gp85的糖基化位点Gly116和Gly219、半胱氨酸Cys60和Cys197对于受体结合和病毒进入至关重要。

目前还没有用于禽白血病防控的疫苗或有效药物，该病主要通过种群进化来控制，而疾病净化是一项长期而复杂的过程，费时费力效率低，迫切需要建立新型有效的防控技术。该研究结果有利于阐明ALVJ入侵宿主细胞的分子机制，为研究抗ALV-J感染鸡的研究提供了重要基因编辑靶点，为抗病育种提供重要技术支撑和理论指导。