斑点叉尾溃烂症的病原鉴定和致病特性

许晓牧,陶敏慧,韩 阳，徐婷婷,樊慧敏,唐庆权,彭开松,刘天龙,田纪景,佘锐萍,朱若林,鲍传和

(1.安徽农业大学动物科技学院，水生健康与公共卫生实验室，合肥 230036；2.中国农业大学动物医学院，北京 100193)

1 材料和方法

1.1 主要试剂

胰蛋白胨大豆蛋白胨肉汤(TSB)、含0.1%考马斯亮蓝(CBB)的胰蛋白胨大豆蛋白胨琼脂(TSA)、水解酪蛋白胨(MH)、水解酪蛋白胨琼脂(MHA)、药敏纸片、微量生化鉴定管购自杭州微生物试剂有限公司。Taq DNA聚合酶购自北京康为世纪生物科技有限公司。DNA胶回收试剂盒购自爱思进生物技术(杭州)有限公司。抗生素标准品购自中国兽药监察所。PCR引物合成和基因测序由通用生物系统(安徽)有限公司完成。

1.2 临床诊断分析

2018年3月18日和3月27日两次到达现场，通过病史询问、水质分析、饲料等投入品检查、体表和鳃的寄生虫检查，进行初步的临床诊断。

1.3 细菌分离纯化

1.4 细菌鉴定

纯化菌分别在MHA、含0.1%的考马斯亮蓝(CBB)的TSA上，25 ℃培养24 h，观察菌落形态。挑单菌落进行革兰氏染色和生理生化指标测定。以纯化菌落为模板，参考朱若林等[11]方法扩增16S rRNA，并进行系统进化分析。

1.5 温度对分离株世代时间的影响

参考 Prescott等[12]方法，测定分离菌分别在15 ℃和25 ℃的TSB中培养的世代时间。

1.6 代表性毒力基因检测

参考朱若林等[11]方法分别检测嗜温性气单胞菌的代表性毒力基因,包括气溶素(aerA)、细胞毒性肠毒素(Act)、热不稳定性肠毒素(Alt)、热稳定性肠毒素(Ast)、溶血素(hlyA)、鞭毛(Fla)、核酶(Exu)、丝氨酸蛋白酶(Ser)、弹性蛋白酶(ahyB)、酯酶(Lip)。参考文献[13，14]检测嗜冷性气单胞菌的代表性毒力基因，包括毒力阵列蛋白基因(vapA)、甘油磷脂胆固醇酰基转移酶(GCAT)。

1.7 动物回归感染

1.8 药敏试验

参考欧盟标准[16]，采用K-B纸片扩散法及MIC肉汤稀释法进行抗菌药物的药敏试验。

2 结果

2.1 临床诊断

2.2 细菌的分离纯化和鉴定

分离的4株细菌，在MHA上25 ℃培养24 h后，形成圆形、表面光滑、边缘整齐、半透明状凸起的灰白色菌落。含0.1% CBB的TSA上生长的菌落为白色，不产色素。分离菌为两端钝圆的革兰氏阴性短直杆菌。生理生化鉴定结果见表1。

PCR扩增分离菌的16S rRNA基因，得预期大小条带，切胶回收后测序，分别得到1 431 bp、1 429 bp、1 425 bp和1 432 bp的基因序列。BLAST比对显示， X-G1与杀鲑气单胞菌无色亚种(HQ283362.1)、X-P2和X-P3与杀鲑气单菌杀鲑亚种(KF751724.1)、X-P4与嗜水气单胞菌(MG428972.1)的相似性最高，分别为99%、96%、99%和99%。综合菌体形态、生理生化鉴定、16S rRNA基因序列和系统进化分析(图1)，可确定X-G1为杀鲑气单胞菌无色亚种、X-P2和X-P3为杀鲑气单胞菌杀鲑亚种，且均为非典型杀鲑气单胞菌；X-P4为嗜水气单胞菌。

表1 菌株X-G1、X-P2、X-P3和X-P4的生理生化特征Tab.1 Biochemical and physiological characteristics of strains X-G1，X-P2，X-P3 and X-P4

注：“+”为阳性，“-”为阴性。

图1 基于16S rRNA基因构建的 X-G1株，X-P2株，X-P3株和X-P4株系统进化树Fig.1 Phylogenetic tree constructed based on 16S rRNA gene of X-G1，X-P2，X-P3 and X-P4

2.3 温度对细菌生长的影响

杀鲑气单胞菌X-G1、X-P2和X-P3在15 ℃的世代时间分别为14.2、13.9、14.1 min，均小于嗜水气单胞菌X-P4的世代时间20.2 min；而在25 ℃培养时，杀鲑气单胞菌X-G1、X-P2和X-P3的世代时间分别为20.2、19.6、20.9 min，均大于X-P4的世代时间15.5 min。

2.4 代表性毒力基因的检测

对嗜温气单胞菌的10种代表性毒力基因检测结果见图2，杀鲑气单胞菌无色亚种X-G1株可检到弹性蛋白酶(ahyB)和溶血素(hlyA)；杀鲑气单胞菌杀鲑亚种X-P2株可检到弹性蛋白酶(ahyB)；杀鲑气单胞菌杀鲑亚种X-P3株可检测到弹性蛋白酶(ahyB)、溶血素(hlyA)、细胞毒性肠毒素(Act)、丝氨酸蛋白酶(Ser)、酯酶(Lip)和气溶素(aerA)；嗜水气单胞菌X-P4株可检到鞭毛(Fla)、弹性蛋白酶(ahyB)、气溶素(aerA)、细胞毒性肠毒素(Act)、热不稳定性肠毒素(Alt)、丝氨酸蛋白酶(Ser)和溶血素(hlyA)。对嗜冷气单胞菌的2种代表性毒力基因检测见图3， 杀鲑气单胞菌无色亚种X-G1株和杀鲑气单胞菌杀鲑亚种X-P3株都可检测到甘油磷脂胆固醇酰基转移酶(GCAT)。4个分离菌株所携带的毒力基因不同(表2)。

图2 X-G1、X-P2、X-P3和X-P4分离株毒力基因的PCR扩增电泳图Fig.2 PCR amplification of virulence genes of X-G1，X-P2，X-P3 and X-P4M：DNA分子质量标准DL2000；1：核酶；2：鞭毛；3：弹性蛋白酶；4：溶血素；5：细胞毒性肠毒素；6：热不稳定性肠毒素；7：热稳定性肠毒素；8：丝氨酸蛋白酶；9：酯酶；10：气溶素；

图3 X-G1、X-P2和X-P3分离株毒力基因的PCR扩增电泳图Fig.3 PCR amplification of virulence genes of X-G1，X-P2 and X-P3M：DNA分子质量标准DL2000；1：毒力阵列蛋白基因2：甘油磷脂胆固醇酰基转移酶

菌株嗜冷气单胞菌毒力基因嗜温气单胞菌毒力基因杀鲑气单胞菌无色亚种X-G1株GCATahyB、hlyA杀鲑气单胞菌杀鲑亚种X-P2株—ahyB杀鲑气单胞菌杀鲑亚种X-P3株GCATahyB、hlyA、Act、aerA、Ser、Lip嗜水气单胞菌X-P4株 /ahyB、hlyA、Act、aerA、Ser、Fla、Alt

注：“—”表示未检测到嗜冷气单胞菌毒力基因；“/”示未进行此项检测

2.5 动物回归感染试验

表3 水温对分离菌株的半数致死浓度(LD50)的影响Tab.3 Effect of water temperature on the lethal concentration 50% of isolated strains CFU/g

表4 分离株混合感染对死亡率的影响Tab.4 Effect of co-infection on the mortality rate of the isolated strains %

2.6 抗菌药物的药敏试验

纸片法和肉汤稀释法的药敏试验均显示分离株对多西环素、恩诺沙星、氟苯尼考敏感(表5和表6)。

表5 抗菌药物对分离菌株的抑菌效应 Tab.5 Antibacterial effect of antibiotics on the isolated strains

表6 抗菌药物对分离菌株的最小抑菌浓度 Tab.6 Minimum inhibitory concentration of antibiotics on the isolated strains μg/mL

2.7 治疗情况

介入诊断和治疗时，大部分患病鱼体表有创伤、溃烂、出血，并继发水霉感染，从口腔到肛门均已经发生严重的溃疡。全池泼洒过碘制剂、水霉治疗剂等外用药。内服使用恩诺沙星等药饵，但病鱼对正常饲料和药饵都已经丧失食欲。最终，本病例治疗以失败告终。

3 讨论

致病菌携带的毒力基因可能与其致病特性有关联[13,14]。本研究中的4个分离菌株所携带毒力基因谱存在差异，且这3株非典型杀鲑气单胞菌不同程度地携带有嗜温气单胞菌的代表性毒力基因。这与李绍戊等[14]从溃烂怀头鲶分离的维氏气单胞菌、杀鲑气单胞菌和嗜水气单胞菌的研究结果类似。非典型杀鲑气单胞菌携带嗜温气单胞菌的某些毒力基因，可能与这些菌株的适应温度或宿主范围扩大有关[17]。

本研究治疗以失败告终，最后四个发病塘死亡率均为100%。综合分析可知，患鱼上一年的11月已发生该病，初步治疗且水温下降后，病情表面缓解，但大部分病鱼体内病菌并未彻底清除。第二年3月中旬，水温上升，嗜冷性的杀鲑气单胞菌又开始大量生长繁殖。3月18日现场诊断时，大部分鱼的体表、鳍条、口腔和消化道均溃烂；而这时水温较低(15.5 ℃)，即使健康鱼的食欲也很差，而感染鱼也因为炎症性厌食而不能摄食。因此，病鱼无法摄入敏感抗菌药物是本病治疗失败的重要原因。3月27日采样分离鉴定细菌时，水温已经上升到24.5℃，达到了嗜温性嗜水气单胞菌生长的适应宜温度，进一步加剧了患鱼的损伤和死亡。因此，由嗜冷性的杀鲑气单胞菌和嗜温性的嗜水气单胞菌在低温期到高温期过渡阶段引起的混合感染，应该引起充分重视。笔者在病史调查中了解到，该池鱼没有拉网或并池。最值得怀疑的发病诱因有两点，一是年前鱼价低，养殖户使用了品质不好的饲料且停食过早；其次，上一年11月份病鱼患溃烂症后，没有彻底治疗好。越冬期鱼体质弱且带菌越冬，可能是本病开春暴发的原因。因此，笔者建议在上一年的秋冬季节，晚停食且使用优质饲料，第二年春季要早开食。如果上一年的秋冬季节，鱼发生溃烂症，一定要彻底治疗，不为第二年开春后的疾病暴发埋下隐患。