二氧化碳麻醉对鲢生理生化指标及神经调控相关基因表达的影响

胡 鑫，丁晨雨， 叶 勤，吴荣华,2，张 倩，李 虹，李 云,2

(1.西南大学动物科技学院重庆三峡生态渔业产业技术研究院，重庆 400715；2.淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室，重庆 400715；3.西南大学化学化工学院，重庆 400715；4.重庆市水产技术推广总站，重庆 400200)

在鱼类运输过程中，使用鱼用麻醉剂能明显减轻鱼类的应激反应，减少经济损失。目前报道有MS-222(三卡因)、苯佐卡因、丁香酚等近30种药物可以作为鱼用麻醉剂[1]。但是这些药物在生产中使用时由于有药物残留，需要休药期等问题，存在较大的安全隐患。因此，开展安全、无残留鱼用麻醉剂的研究非常必要。已有文献表明，CO2对鱼类具有麻醉作用[2,3]，与其它镇静剂相比较，CO2具有无药物残留、无休药期，对人和环境无害等优点，是一种有着良好发展前景的鱼用麻醉剂[4,5]。迄今，有关鱼类CO2麻醉的报道主要集中在麻醉效果及生理指标影响方面[6,7]，针对大宗淡水养殖鱼类CO2麻醉的报道较少[8]，尤其是CO2麻醉对鱼类神经调控机制的影响未见报道。

鲢(Hypophthalmichthysmolitrix)作为大宗淡水养殖鱼类之一，在保障水产品供给方面具有重要作用。鲜活鲢运输常使用充氧有水运输，但鲢抗应激能力差，在高密度养殖、气温气压骤变、长途运输、装卸的情况下，较其它鱼类更容易产生应激反应，导致鱼体损伤甚至死亡，造成经济损失。本研究以鲢为对象，研究CO2处理对鲢的麻醉效应、血清代谢和应激指标变化、脑神经递质含量和神经调控相关基因表达的影响，为鱼类CO2麻醉机制的研究提供基础资料，为鲢保活运输技术提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验鲢体长(15.73 ± 0.81) cm、体重(53.70 ± 8.00) g，购于重庆市沙坪坝区双连水库。暂养15 d后挑选健康且规格一致的鲢用于实验。CO2麻醉装置和工艺参照文献[8]。实验前停食24 h，分别置于实验水体为5 L的密封鱼缸并放入温度为25 ℃的恒温箱中进行实验。根据预实验结果确定CO2浓度为(155 ± 15) mg/L开展后续实验。

设两个处理组，每组设6个平行，每个平行组5尾鱼。第一组CO2麻醉处理，O2初始浓度为(8.46 ± 0.25) mg/L，CO2初始浓度为(155 ± 15) mg/L；第二组充O2处理，O2初始浓度为(9.74 ± 0.65) mg/L。两组在处理15 h和恢复通空气24 h两个时间点随机取9尾鱼进行取样。对照组为正常暂养鲢，用开放鱼缸持续通空气，溶解氧为(7.47 ± 0.55) mg/L，在暂养停食24 h后随机取9尾鱼进行取样。

1.2 实验方法

观察各组鲢的呼吸频率(次/min)，并记录其行为状况。使用PHS-25型精密pH计、便携FlveGo溶解氧测定仪、FC-100型水中CO2测定仪对实验前后水体中pH、溶解氧和CO2浓度进行检测。在各时间点采血分离血清，取鱼体脑、肝胰脏组织，-80 ℃保存，用于后续测定。血清钙离子(Ca2+)、血清钾离子(K+)、血清乳酸(LD)、血清尿素氮(BUN)、肝糖原(GLY)、脑乙酰胆碱(Ach)含量测定参照南京建成生物工程研究所试剂盒说明书。鱼皮质醇(COR)、鱼多巴胺(DA)、鱼5-羟色胺(5-HT)指标测定参照慧嘉生物ELISA试剂盒说明书。

采样常规qPCR技术检测鲢脑组织kcnk3、kcnk9、hif-1α和epo基因表达量的变化。NCBI中查找近源物种的基因序列，qPCR引物由Primer Premier 5.0设计，并由擎科生物技术有限公司合成(表1)。内参基因ef-1α的引物参考丁晨雨等[9]，每个样品做3个技术重复，在95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，退火温度退火1 min，72 ℃延伸10 min，40个循环。记录基因扩增曲线及Ct值，用2-ΔΔCT法分析kcnk3、kcnk9、hif-1α和epo基因的表达变化。

表1 qPCR扩增目标基因的引物序列Tab.1 Primers of target genes amplification for qPCR

1.3 数据处理

使用Excel 2010和SPSS 22软件处理数据，单因素方差分析法分析数据差异显著性(P<0.05)，Origin 8.5绘制数据柱状图。

2 结果

2.1 CO2麻醉对鲢的呼吸频率和感觉影响

0.5 h后，正常对照组鲢呼吸频率(62.87 ± 2.45)次/min，CO2麻醉组鲢呼吸频率(39.60 ± 5.03) 次/min，显著降低，且平衡性降低，对听觉和视觉刺激反应也降低。O2处理组0.5 h后，呼吸频率为(61.73 ± 2.99) 次/min，与正常对照组差异不显著，对听觉和视觉反应迅速。

2.2 鲢血清生理生化指标变化

充CO2、O2处理15 h后两组鲢血清K+均显著升高，恢复充气后均发生显著回降，但CO2组复苏后鲢血清K+接近对照组。两种处理组处理15 h后Ca2+均无显著变化，恢复充气后均发生显著性下降(表2)。

表2 O2和CO2处理鲢血清生理生化指标和肝糖原变化Tab.2 The Changes of serum physiological and biochemical indexes and liver glycogen of O2 and CO2treatment groups in silver carp

注：同行数值间上标不同字母表示差异显著显著(P<0.05)，下同。

两组鲢血清乳酸(LD)和尿素氮(BUN)水平在处理15 h后均显著升高，尤其是BUN水平，几乎达到对照组(8.97±2.22) mmol/L水平的2～3倍；恢复充气后，LD水平和BUN水平仍显著高于对照组。结果表明，CO2处理组鲢血清中LD、BUN水平在各个时期均显著低于充O2处理组(表2)。

血清皮质醇(COR)水平在CO2处理组与对照组无显著差异，而O2处理组鲢血清COR则显著升高到(94.06±11.46) mg/L，是对照组(39.85±7.30) mg/L的2倍多。恢复充气后CO2复苏组血清COR水平无显著变化，O2复苏组则显著降低至正常水平。结果表明，CO2处理组血清COR水平显著低于O2处理组(表2)。

2.3 鲢肝糖原的变化

CO2和O2处理后，两组肝糖原(GLY)含量均显著降低，恢复充气后，CO2复苏组仍显著低于对照组，O2复苏组则恢复至正常含量。结果表明，CO2处理组GLY含量在各个时期都显著低于充O2处理组(表2)。

2.4 CO2麻醉鲢脑组织乙酰胆碱、多巴胺和5-羟色胺含量的变化

鲢经CO2麻醉后，乙酰胆碱(Ach)含量轻微升高，多巴胺(DA)和5-羟色胺(5-HT)含量有所下降，下降幅度不大，但经过充气复苏后，三种神经递质含量均升高，尤其是DA含量显著升高(表3)。

表3 CO2处理鲢脑组织乙酰胆碱、多巴胺和5-羟色胺的变化Tab.3 The changes of Ach，DA and 5-HT contents of brain tissue of CO2 treatment group in silver carp pg/mg prot

2.5 CO2麻醉后脑神经调控相关基因kcnk3a、kcnk9、epo和hif-1α表达的变化

设鲢脑组织上述基因在正常情况下的表达量为1，鲢经CO2处理后15 h，脑组织kcnk3a、kcnk9、epo和hif-1α各基因相对表达量分别上调了123%、158%、366%和22%。复苏后kcnk3a、kcnk9和epo基因表达量发生显著性降低，hif-1α基因表达量与对照组间显著差异(图1)。

图1 二氧化碳处理鲢脑组织kcnk3a、kcnk9、epo和hif-1α基因表达的变化Fig.1 The changes of gene expressions of kcnk3a，kcnk9，epo and hif-1α of in brain tissue of CO2 treatment group in silver carp CO2处理组表示CO2麻醉处理后15 h，恢复充气组表示恢复充气后24 h，对照组表示正常充气对照组。不同小写字母表示各个基因不同处理方式mRNA差异显著。

3 讨论

3.1 CO2 麻醉对鲢应激生理指标的影响

神经递质Ach、DA和5-HT可能是麻醉的作用靶位[10]，鱼类发生应激反应时，DA和5-HT含量显著上升[11,12]。本实验中鲢在CO2麻醉处理后脑神经递质DA和5-HT含量减少，复苏后增多，表明CO2可能阻碍鲢脑神经递质分泌，阻碍神经细胞突触间信号传递而起麻醉作用。已有的研究表明，鱼类受到急性胁迫后在几分钟之内血液皮质醇水平迅速上升，受到慢性胁迫时血液皮质醇也会缓慢持续升高，恢复到正常水平需要数小时[13]。因此，COR被广泛用作鱼体应激反应的量化指标[14]。血液COR升高幅度与应激因子强度和作用时间呈正相关[15]。本实验中CO2处理组鲢血清COR含量轻微升高，而O2处理组显著升高，表明鲢在CO2麻醉方式下产生的应激程度较一次性充O2方式更低。这与黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)和罗非鱼(Oreochromisspp.)用其它麻醉剂处理后的结果相似[16,17]。

3.2 CO2麻醉对鲢血清生化指标的影响

本研究中，CO2和O2两个处理组在15 h时均处于缺氧状态，此时机体为了维持能量需要，肝糖原加速分解产生葡萄糖而导致肝糖原显著下降。恢复充气后，糖原分解速率低于糖原合成速率，糖异生途径使肝糖原累积。血清中LD是衡量无氧代谢强度的重要指标[18]，两组鲢血清LD含量均显著升高，鲢的无氧代谢均加强以满足能量需求，恢复充气后供氧充足，但是血液中的LD代谢较慢，需要数天才能恢复正常，白斑狗鱼(Esoxlucius)、黄颡鱼、罗非鱼和金鲳(Trachinotusovatus)的研究中均有相似发现[3,19-20]。相比充O2处理，CO2麻醉处理的代谢物指标显著降低，说明CO2麻醉可以有效降低鲢的新陈代谢，有利于鱼体保活。

本研究中，血清K+在两种处理组均显著升高，此时水体中溶氧较低，鱼体处于缺氧状态，加上血清LD升高，均会导致pH下降，此时，K+易从细胞内逸出到细胞外，从而导致血清K+上升[21]。麻醉处理后血清中含量相对稳定，恢复充气24 h后，血清Ca2+显著性下降，推测是由于鲢恢复后机体活动增加，细胞能量代谢加强，神经、肌肉细胞增加了对Ca2+吸收，导致血清Ca2+水平下降。

CO2和O2两种处理中鲢血清BUN都发生了显著升高，表明肾功能出现障碍或部分受损[22]，但CO2麻醉处理鲢血清BUN升高的幅度较充O2处理小，这可能是因为鲢处于麻醉状态，氨基酸代谢降低所致，此外鲢的肾脏在缺氧状态下可能出现排泄障碍，BUN没有被有效排出体外使得BUN含量高于正常水平，这与罗非鱼的研究结果一致[23]。

3.3 CO2麻醉对鲢脑组织神经调控相关基因表达的影响

kcnk3a和kcnk9基因均为双孔K+通道蛋白家族(K2P)成员，是麻醉剂的作用靶点，可被麻醉剂、酸化、低氧和渗透压等因素调控[24,25]。本研究结果显示CO2麻醉导致kcnk3a和kcnk9基因的表达量增加，可能激活K2P使K+通道产生了外向电流，造成细胞膜超级化现象，从而降低了神经元的兴奋性，减轻了低氧胁迫对鲢神经细胞的损伤，这与氟烷和异氟烷的麻醉研究和缺氧损伤研究结果一致[26-28]。

本研究发现鲢经CO2麻醉后，水体中溶氧降至(1.07±0.15) mg/L，诱导脑组织中低氧诱导因子hif-1α基因表达上调。epo作为促红细胞生成素基因，其表达与释放受hif调控[29]，在缺氧条件下，epo产物可以通过激活抗氧化酶活性促进神经元再生等方式保护脑内神经细胞[30]。CO2麻醉后epo显著上调了3.66倍，可能因为CO2麻醉造成了鲢缺氧激活了hif-epo调控通路，hif-1α进入细胞并到达细胞核内与DNA的缺氧反应基因启动子相结合，促进epo基因转录[31]，使脑神经系统避免低氧损伤，以维持鲢的正常生命活动。

以上研究结果表明，一定浓度CO2处理对鲢具有麻醉作用。CO2麻醉可能通过降低脑组织神经递质含量降低神经细胞兴奋性，并激活K+通道产生外向电流，使神经细胞膜超级化，中枢神经系统受到影响，进而产生激素分泌紊乱、新陈代谢变慢和应激反应减缓等效应。CO2麻醉对神经递质的作用机制以及低氧诱导信号通路在麻醉过程的作用需要进一步的研究。综上所述，CO2麻醉处理鲢是一种安全有效的方法，较一次性充氧处理，可以显著降低鲢新陈代谢，有效减缓其应激反应。