薄壳山核桃CiSULTR2.1基因的克隆与表达分析

倪钟涛 李财运 胡旭雅 李 阳 曾 皓 舒李露 王正加

(浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室,浙江杭州 311300)

硒(Se)是一种人体必需的微量元素,具有抗癌、保心保肝、防治近视和白内障、提高免疫力、延缓衰老和增强生殖功能等多种药理作用,享有“心脏的守护神”和“抗癌之王”的美誉[1]。硫酸盐转运蛋白(sulfate transporter,SULTR)是一类主动转运硫酸盐的载体蛋白,研究表明,SULTR在硫素的吸收、长距离运输、硫同化、光合作用和细胞器运输中发挥重要作用[2]。硒和硫(S)是同一主族元素,硒酸盐(selenate)和硫酸盐(sulfate)具有相似的物理化学性质[3]。硫酸盐和硒酸盐均能够通过植物根系的吸收,经硫转运途径进入植物体内,且二者相互竞争影响植物对它们的吸收[4-5]。植物根系对不同形式的硒盐吸收能力不同,其中对亚硒酸盐是被动吸收,其在植物体内的积累浓度低于土壤环境；而对硒酸盐的吸收是依赖转运蛋白的主动吸收,其在体内的积累浓度高于土壤环境[5-7]。

Smith等[8]最早从柱花草(Stylosantheshamata)的cDNA文库中克隆到3个SULTR基因,之后相继报道了拟南芥[9](Arabidopsis thaliana)、玉米[10](Zea maysL.)、大豆[11][Glycine max(Linn.)Merr.]和水稻[12](Oryza sativa)等植物中SULTR基因克隆及功能分析等方面的研究。拟南芥SULTR2.1通过低亲和力将硫酸盐或硒酸盐从根皮层转运到木质部薄壁细胞,是负责长距离运输的主要转运蛋白[13]。White等[14]研究表明,硫酸盐会抑制拟南芥根系对硒酸盐的吸收,硫酸盐和硒酸盐二者相互竞争硫转运途径,因而高浓度硒酸盐会使植物积累大量的硒元素从而引发毒性效应。Shibagaki等[15]在硒盐胁迫下,分离并鉴定了2个缺乏硫酸盐转运蛋白的拟南芥突变体,此类突变体对硒酸盐具有耐受性且根长较野生型明显增加,表明硒酸盐通过硫酸盐转运蛋白进入植物体,突变体植物不受硒毒害威胁且生长较好。

目前,薄壳山核桃[Carya illinoinensis(Wangenh.)K.Koch]中有关硫转运蛋白和硒元素的报道尚鲜见。本研究从薄壳山核桃的转录组数据库中筛选出与硫酸盐转运蛋白基因高度相似的同源序列,通过RT-PCR和PCR技术克隆得到薄壳山核桃硫酸盐转运蛋白基因CiSULTR2.1的cDNA序列,利用生物信息学方法分析基因的系统发育和蛋白结构,利用RT-qPCR技术研究基因在硒处理后不同时间以及薄壳山核桃不同组织中的表达变化,以期为薄壳山核桃硒吸收机制的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及前处理试验

选取生长一致的一年生薄壳山核桃实生苗,洗净根部泥土,通气水培15 d后移至营养液中培养(表1),用气泵保持24 h通气,营养液每7 d更换一次。对照(Se1):原营养液培养；处理:营养液中加入0.5(Se2)、5(Se3)、10(Se4)、20(Se5)、40(Se6)、80 μmol·L-1(Se7)不同浓度Na2SeO4溶液,每个处理3个重复,每个重复3株幼苗,40 d后观察表型变化。根据薛瑞玲等[16]的方法研究不同浓度硒酸盐对小白菜生长生理特性影响,选取 0.5(促进)、40(抑制)、80 μmol·L-1(毒害)3 个硒酸盐浓度分别处理 0、6、12、24、48 h后取幼苗完整幼根及顶端无病虫害的幼嫩叶片用于RT-qPCR分析,经液氮速冻后,-80℃保存备用。

表1 霍格兰营养液配比Table 1 Hoagland nutrient solution ratio

1.2 试验方法

1.2.1 薄壳山核桃幼苗生长指标的测定 按照地上、地下两部分分离幼苗,采用BSA423S-CW电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]依次称量,精确度为0.001 g,并统计幼苗的叶片数。使用直尺测定地上、地下部分长度,精确度为1 mm[17]。

1.2.2 薄壳山核桃幼苗根叶硒含量的测定 薄壳山核桃幼苗根叶的硒含量采用GB 5009.268-2016[18]中电感耦合等离子质谱法(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)测定。

1.2.3 薄壳山核桃幼根和叶片RNA的提取及cDNA合成 利用CTAB法[19]结合minibest universal RNA Extraction Kit 9767试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司]提取薄壳山核桃幼根和叶片的 RNA,并通过NanoDrop分光光度计(Thermo Fisher,美国)检测RNA的纯度和浓度,采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性,总RNA于-80℃保存备用。利用PrimeScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒[TaKaRa公司(日本)]反转录合成 cDNA用于基因克隆；利用PrimeScriptTMRT Reagent Kit试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司]以处理不同时间和部位的样品总RNA为材料合成cDNA,用于基因表达分析。

1.2.4 目的基因的克隆与测序 根据薄壳山核桃CiSULTR2.1的cDNA序列,利用ORF finder查找最大开放阅读框(open reading frame,ORF),设计上、下游引物(表2)进行PCR扩增验证。PCR扩增以根部cDNA为模板,反应程序:94℃预变性3 min；94℃变性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸2 min,30个循环；72℃延伸5 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳,用凝胶回收试剂盒[TaKaRa公司(日本)]回收目的片段,连接至pMD18-T载体[TaKaRa公司(日本)],转化大肠杆菌DH5α菌株(浙江农林大学经济树种分子生物学实验室保存),经菌落筛选及菌检后将阳性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.2.5CiSULTR2.1的生物信息学分析 采用BLAST对基因核苷酸和氨基酸序列进行相似性分析；ORF finder对基因序列的ORF和编码的蛋白质序列进行分析；DNAMAN对测序结果进行拼接与比对,并且进行多序列比对分析；SMART分析蛋白质的保守结构域；Protparam分析蛋白质的理化性质；SOPMA预测蛋白质的二级结构；MEGA7.0构建系统进化树；ProtScale分析蛋白质的疏水性/亲水性；SignalP预测蛋白质的信号肽；WoLFPSORT和TargetP预测蛋白质的亚细胞定位；TMHMM预测蛋白质的跨膜结构；SWISSMODEL软件预测蛋白质的三级结构。

1.2.6CiSULTR2.1的表达分析 根据CiSULTR2.1基因序列设计RF-qPCR特异引物(表2),模板cDNA根据浓度稀释至500 ng·μL-1。RT-qPCR反应体系:SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ 5 μL,cDNA 0.5 μL,正反向引物各0.4 μL,加无菌水补足至10 μL,重复3次。PCR扩增反应在CF×96 TM Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad,美国)仪器上进行,反应程序:95℃预变性3 min；95℃变性10 s,60℃退火30 s,40个循环；最后从65℃以每隔5 s上升0.5℃的速度升至95℃。以U6为内参基因,默认条件下读取Ct值,采用2-△△Ct法[20]计算基因相对表达量。

1.3 数据分析

采用GraphPad Prism 5软件作图,采用Microsoft Office Excel 2016统计数据,采用SPSS 19.0对数据进行显著性分析。

表2 引物序列Table 2 Sequence of primers

2 结果与分析

2.1 不同浓度硒酸盐处理对薄壳山核桃幼苗生长的影响

由图1可知,不同硒酸盐处理对薄壳山核桃的生长存在较大的差异,与 Se1相比,Se2、Se3、Se4、Se5处理下幼苗根系发达,叶片较多。Se6、Se7处理下幼苗根系较短,叶片较少。由表3可知,随着硒酸盐浓度的增加,薄壳山核桃幼苗地上重量、地下重量、地下长度和叶片数差异明显,整体呈先增加后减少的趋势,各处理间地上长度差异不显著。Se7处理下幼苗地上重量、地下长度和叶片数均显著低于Se1。

图1 硒酸盐处理下薄壳山核桃幼苗的生长情况Fig.1 Growth of pecan seedlings treated with selenate

表3 硒酸盐对薄壳山核桃幼苗地上和地下部分生长的影响Table 3 Effect of selenate on the growth of above ground and underground parts of pecan selenate

2.2 不同浓度硒酸盐处理下薄壳山核桃幼苗根叶中硒含量分析

由图2可知,随着硒酸盐浓度的增加,薄壳山核桃幼苗根、叶的硒含量均呈先升高后降低的趋势,且根的硒含量总体上大于叶。根、叶中硒含量均在硒酸盐液浓度为 40 μmol·L-1达到最大值。

图2 不同浓度硒酸盐处理对薄壳山核桃幼苗硒含量的影响Fig.2 Effects of different selehate concentrations on selenium content in pecan seedlings

2.3 CiSULTR2.1的cDNA克隆

以薄壳山核桃幼苗根的cDNA为模板,扩增得到长为1 902 bp的序列,经比对分析,获得硫转运蛋白同源基因CiSULTR2.1(图3)。分析全长开放阅读框,结果表明其编码633个氨基酸(图4)。利用NCBI网站BLAST将CiSULTR2.1的核苷酸序列和氨基酸序列进行比对,结果发现CiSULTR2.1核苷酸序列与胡桃(Juglans regia,ID:XM_018973400.1)、栓皮栎(Quercus suber,ID:XM_024048776.1)和梅花(Prunus mume,ID:XM_008235771.2)的SULTR2(第二亚族)基因核苷酸序列的相似性较高,分别为 97.06%、84.28%和76.91%(图 5)。CiSULTR2.1氨基酸序列与胡桃(Juglans regia,ID:XP_018828945.1)、栓皮栎(Quercussuber,ID:POE45311.1)和甜橙(Citrus sinensis,ID:XP_006472651.1)的SULTR2蛋白氨基酸序列的相似性分别为96.68%、79.15%和74.61%(图6)。

图3 CiSULTR2.1的cDNA全长扩增Fig.3 The cDNA full-length amplification of CiSULTR2.1

图4 CiSULTR2.1基因核苷酸及推测的氨基酸序列Fig.4 The nucleotide and deduced amino acid sequence of CiSULTR2.1

图5 CiSULTR2.1与其他植物SULTR2核苷酸序列的相似度Fig.5 Similarity of nucleotide sequences between CiSULTR2.1 and SULTR2 of other plants

图6 CiSULTR2.1与其他植物SULTR2氨基酸序列的相似度Fig.6 Similarity of amino acid sequences between CiSULTR2.1 and SULTR2 of other plants

2.4 CiSULTR2.1蛋白基本理化性质分析

2.4.1 CiSULTR2.1蛋白保守结构域分析ProtParam分析表明,CiSULTR2.1蛋白的分子式为C3152H5058N802O866S28,分子质量为68 943.37 Da,理论等电点为9.03,负电荷氨基酸残基总数(Asp+Glu)为44,正电荷氨基酸残基总数(Arg+Lys)为53,总体亲水性为0.531,脂溶性指数为117.68,不稳定系数为36.79,属于稳定蛋白。

SMART分析表明,CiSULTR2.1蛋白具有硫酸盐转运蛋白典型的结构域,其中,在N-的Sulfate-transp结构域(PF00916,95～477)同源性较高,包含了8个TMDs；C-的 STAS结构域(PF01740,528～614)是硫酸盐转运蛋白的抗σ因子(anti-sigma factor)(图7)。

图7 CiSULTR2.1蛋白的保守结构域Fig.7 Conservative domains of CiSULTR2.1 protein

2.4.2 CiSULTR2.1蛋白疏水性/亲水性预测ProtScale分析表明,CiSULTR2.1蛋白疏水区和亲水区差别明显,其中第444位疏水性最强,分数为3.156,第568位亲水性最强,分数为-2.678(图8)。综上表明CiSULTR2.1蛋白为疏水性蛋白。

2.4.3 CiSULTR2.1蛋白二级结构预测 SOPMA分析表明,依次有324、198、80、31个氨基酸参与形成α-螺旋(α-helix)、无规则卷曲(random coil)、延伸链(extended strand)和 β-转角(β-turn),占比分别为51.18%、31.28%、12.64%和 4.90%(图 9)。 表明CiSULTR2.1蛋白二级结构中含有丰富的α-螺旋和无规则卷曲,其中α-螺旋可参与形成多个跨膜结构域。

图8 CiSULTR2.1蛋白疏水性/亲水性预测Fig.8 Prediction of the hydrophobic/hydrophilic of CiSULTR2.1 protein

2.4.4 CiSULTR2.1蛋白信号肽预测和亚细胞定位预测 SignalP预测显示,CiSULTR2.1蛋白无信号肽输出位点,属于非分泌蛋白。TargetP预测显示,该蛋白定位在叶绿体和线粒体上的可能性较小,且不属于分泌蛋白；WoLFPSORT预测显示,CiSULTR2.1蛋白主要定位在膜内,是一种膜内在蛋白。上述结果表明CiSULTR2.1蛋白具有跨膜结构域,可能参与硫酸盐在细胞内的跨膜转运。

2.4.5 CiSULTR2.1蛋白跨膜结构域及三级结构的预测 对CiSULTR2.1蛋白跨膜结构域的预测表明,CiSULTR2.1蛋白具有8个TMDs,分布于第180～第493位(图10),表明CiSULTR2.1蛋白属于跨膜蛋白。SWISS-MODEL预测显示,CiSULTR2.1蛋白含有14个α-螺旋,这些α-螺旋相互围绕形成一个通道结构,实现对硫酸盐的跨膜转运(图11)。

图9 CiSULTR2.1蛋白二级结构预测Fig.9 Prediction of the secondary structure of CiSULTR2.1 protein

图10 CiSULTR2.1蛋白跨膜结构域预测Fig.10 Prediction of the transmembranedomain of CiSULTR2.1 protein

2.5 CiSULTR2.1蛋白序列的同源性与系统进化分析

利用DNAMAN软件对薄壳山核桃与其他物种SULTR(第二亚族)基因编码的氨基酸序列进行多重比较分析(图12),发现序列比对的一致性达到72.39%,薄壳山核桃与其他物种具有较高的同源性,均含有Sulfate-transp结构域和STAS结构域,表明不同物种的SULTR氨基酸序列的保守性较高,但在长度和氨基酸组成上存在差异性。

图11 CiSULTR2.1蛋白三级结构预测Fig.11 Prediction of the tertiary structure ofCiSULTR2.1 protein

根据 10个 SULTR基因的氨基酸序列,利用MEGA7.0软件构建进化树。由图13可知,薄壳山核桃与胡桃、栓皮栎聚为一大类,并与胡桃的亲缘关系最近。木薯与橡胶聚为一类,榴莲与可可聚为一类,其他物种各为一类。

2.6 CiSULTR2.1的表达分析

由图14可知,CiSULTR2.1在根、叶中均有表达。不同浓度硒酸盐处理6 h,根、叶中CiSULTR2.1的相对表达量均与对照相近,而处理12 h时Se6、Se7根和叶中表达量均极显著高于对照,之后出现不同程度的下降。Se2根和叶中CiSULTR2.1的表达高峰延迟至处理48 h,处理12、24 h时,根和叶中CiSULTR2.1相对表达量与对照相近。在根中,处理 24 h时 Se6CiSULTR2.1的相对表达量仍高于对照；在叶中,处理24 h和48 h时Se6、Se7CiSULTR2.1的相对表达量均极显著低于对照。CiSULTR2.1在根、叶中的相对表达量(除Se2)均随着硒酸盐处理时间的延长,总体呈先上升后下降的趋势。

图13 CiSULTR2.1与其他植物SULTR2蛋白的系统进化树分析Fig.13 Phylogenetic analysis of protein between CiSULTR2.1 and SULTR2 of other plants

图14 根、叶中不同浓度硒酸盐处理后CiSULTR2.1的表达分析Fig.14 Expression analysis of CiSULTR2.1 in root or leaf after treatment with different concentrations of selenate

3 讨论

本研究从薄壳山核桃中克隆得到CiSULTR2.1基因,开放阅读框序列长度为1 902 bp,编码633个氨基酸,与前人报道SULTR基因长度范围一致[21-23]。通过生物信息学分析,CiSULTR2.1蛋白包含Sulfatetransp结构域(PF00916)和STAS结构域(PF01740),STAS结构域是RNA聚合酶指导基因转录的一种抑制子,其过量表达甚至本体表达都会导致基因转录的关闭,进而控制基因的表达[24]。研究表明,酵母中硫转运蛋白功能依赖于STAS结构域,该区域与硫转运蛋白的活性和稳定性密切相关[25]。CiSULTR2.1蛋白具有8个跨膜结构域,是定位于膜内的跨膜转运蛋白,其三级结构含有14个α-螺旋,且α-螺旋相互围绕形成通道对硫酸盐进行跨膜转运。这与前人在马铃薯(SolanumtuberosumL.)[21]、短柄草(Brachypodium distachyon)[22]、高粱(Sorghum bicolorL.)[23]上的研究结果一致。

根据序列的同源性,硫转运蛋白基因可分为4个亚族,其中CiSULTR2.1属于第2亚族,主要负责硫酸盐从根系向地上部分的长距离转运[25],同时其表达也受到硒酸盐的调控。目前,在拟南芥[9]和马铃薯[21]中均克隆出12种SULTR基因,短柄草中得到10种SULTR基因[22],高粱中得到11种SULTR基因[23],不同亚族成员的表达具有组织和时空的特异性[26]。

本研究结果表明,不同浓度硒酸盐处理对薄壳山核桃幼苗生长有不同的影响。随着硒酸盐浓度的增加,薄壳山核桃幼苗地上重量、地下重量、地下长度和叶片数个别组间差异显著且均呈先增加后减少的趋势,表明低浓度硒酸盐可以促进薄壳山核桃幼苗生长,高浓度硒酸盐会抑制幼苗生长。RT-qPCR技术分析CiSULTR2.1基因的表达发现,其在薄壳山核桃幼苗根、叶中均有表达,且呈现一定的规律性。40、80 μmol·L-1硒酸盐处理 12 h时,CiSULTR2.1出现表达高峰,此后相对表达量明显下降；而0.5 μmol·L-1硒酸盐处理下,CiSULTR2.1表达高峰出现时间延后至处理48 h,这与茶树[3,27]上的研究结果一致。表明CiSULTR2.1对硒元素在薄壳山核桃中的转运发挥作用,且CiSULTR2.1在短时间内能够快速响应高浓度硒酸盐的诱导,而低浓度硒酸盐需要较长时间才能诱导CiSULTR2.1表达。本研究结果表明,高浓度硒酸盐处理时间过长,CiSULTR2.1相对表达量显著下降且低于对照,表明高浓度硒酸盐对幼苗产生毒性效应[5],这与赵文龙等[28]对小白菜施加高浓度硒酸盐后产生毒害作用的研究结果一致,即高浓度硒酸盐处理下植物体通过降低基因的表达,减少对硒酸盐的吸收。此外,当硒浓度≤40 μmol·L-1时,根、叶中硒含量与硒酸盐处理浓度呈正相关,这与刘华山[29]对生菜的研究结果一致。本研究中,80 μmol·L-1硒酸盐处理下幼苗根和叶中硒含量明显减少,表明 40～80 μmol·L-1之间存在某个浓度使得幼苗的硒含量达到峰值。

4 结论

本研究克隆了薄壳山核桃CiSULTR2.1基因的全长cDNA序列,其ORF序列长1 902 bp,编码633个氨基酸,具有典型的sulfate-transp结构域(PF00916)和STAS结构域(PF01740)。利用不同浓度的硒酸盐处理薄壳山核桃水培幼苗,发现低浓度硒酸盐处理下幼苗生长较好。幼苗的硒含量随着硒酸盐浓度的增加而增加,40、80 μmol·L-1间存在某一个浓度使得幼苗的硒含量达到峰值。通过对CiSULTR2.1基因的高表达分析发现,40、80 μmol·L-1高浓度硒酸盐能够快速诱导CiSULTR2.1 基因的高表达；而 0.5 μmol·L-1低浓度硒酸盐需要较长的时间才能诱导CiSULTR2.1基因的高表达。本研究仅克隆了1个CiSULTR基因,对其他CiSULTR基因的克隆及表达分析有待进一步深入研究。