离体条件下评价二倍体马铃薯(Solanum phureja×S.stenotomum)耐盐性

赵明辉 白雅梅 吕文河

(1哈尔滨学院食品工程学院,黑龙江哈尔滨 150086；2东北农业大学农学院,黑龙江哈尔滨 150030；3东北农业大学资源与环境学院,黑龙江哈尔滨 150030)

盐碱土是陆地上广泛分布的一种土壤类型,全世界约有9.5亿hm2的盐渍化土壤[1]。我国盐碱地面积约有1亿hm2,主要分布在东北、西北、华北内陆以及沿海地区等[2]。同时,受气候、人为等因素的影响,土壤的次生盐渍化日趋严重。而在盐碱地上种植耐盐作物,不但可以改良盐碱地,还可以缓解目前我国耕地面积不足的现状,进而提高土地利用率[3]。因此,培育耐盐作物品种具有重要意义。近年来,大量研究者对小麦[4-5]、水稻[6-7]、玉米[8-9]、大豆[10-11]、高粱[12]、棉花[13-14]等作物进行了种质资源耐盐性鉴定与筛选,并表明耐盐种质资源的多样性越丰富,改良栽培品种或选育新品种的潜力就越大。但目前关于马铃薯(Solanum tuberosumL.)种质资源耐盐性鉴定与筛选的研究并不常见。

马铃薯是粮、菜、饲和工业原料兼用的重要农作物,也是盐中度敏感作物[15-16]。目前生产上应用的马铃薯品种属于普通栽培种,为同源四倍体,其亲本材料遗传基础较狭窄[17],而二倍体马铃薯中蕴含多种有价值的基因[18-20],如富利亚(S.phureja,PHU)和窄刀薯(S.stenotomum,STN)的杂种群体(PHU-STN),是美国研究者经过12次轮回选择改良的适应长日照的原始二倍体栽培种杂种群体,其具有丰富的遗传变异性,是拓宽马铃薯遗传背景的重要种质资源[21]。

离体植物培养能在植物不同的发育阶段鉴定植物耐受胁迫的潜力[22]。目前已有研究者利用组织培养技术研究马铃薯的耐盐性,如Zhang等[23]分别利用单茎段、根尖和微型薯组织培养鉴定马铃薯的耐盐性,发现3种培养方式下马铃薯的耐盐性一致,且单茎段培养操作更方便；姜丽丽等[24]在组培条件下通过测定株高、茎叶鲜重、根鲜重等9个指标鉴定了10个马铃薯品种的耐盐性；周明扬[25]在组培条件下通过测定株高、植株鲜重等4个形态指标和叶绿素含量、脯酸含量等4个生理指标鉴定了4个马铃薯品种的耐盐性。以上研究多针对四倍体马铃薯栽培品种的耐盐性鉴定,而对二倍体马铃薯种质资源的耐盐性评价研究鲜见报道。本研究在组织培养条件下,以166个二倍体马铃薯PHU-STN杂种无性系试管苗为试验材料,通过NaCl胁迫,测定芽长、芽鲜重、芽干重、根长、根鲜重和根干重6个形态指标,评价二倍体马铃薯无性系的耐盐性,以期为快速评价大量马铃薯种质资源的耐盐性和马铃薯耐盐育种提供理论依据和材料基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为166个二倍体栽培种PHU-STN杂种无性系,包括164个后代无性系和其亲本(母本472-1为耐盐亲本,父本270-2为盐敏感亲本)。亲本经NaCl胁迫筛选而来,以四倍体马铃薯品种Bintje(母本)为耐盐对照,以Mainechip(父本)为盐敏感对照进行品种筛选[26]。

将亲本杂交后获得的实生种子约350粒浸泡消毒后,接种至MS培养基上,置于温度20±2℃,光照强度2 000～3 000 Lx,光周期16 h光照/8 h黑暗的组培室内培养,约有180粒种子发芽并长成幼苗,进行扩繁保存。每粒实生种子为一个基因型,最后能被保存下来并被用于试验的共164个基因型,即164个后代无性系。

1.2 试验方法

参考Zhang等[23]和张景云[26]的方法,分别进行40、80 和 120 mmol·L-1NaCl胁迫的预备试验,试验过程中观察发现,NaCl浓度过高会导致有些无性系不萌发新叶芽,或长出叶芽后停止生长,甚至死亡；NaCl浓度过低不能很好地区分出无性系间的耐盐性差异,因此,本研究选择80 mmol·L-1NaCl进行胁迫处理(pH值5.8),以0 mmol·L-1NaCl处理为对照(CK,pH值5.8)。分别取166个无性系21 d苗龄的组培苗,去除顶端和最下部,剪成约1 cm长并带有1个叶芽的茎段,分别接种至含有 0 mmol·L-1和 80 mmol·L-1NaCl的MS培养基上,每个浓度接种5瓶,培养瓶为装有40 mL培养基的100 mL三角瓶,每瓶接种10个茎段,置于温度20±2℃,光照强度2 000～3 000 Lx,光周期16 h光照/8 h黑暗的组培室内培养。培养28 d后,选取瓶内组培苗未被污染的培养瓶进行形态指标的测定,每个浓度随机取3瓶。形态指标包括芽长、芽鲜重、芽干重、根长、根鲜重和根干重。其中,芽长为茎段生长点至苗顶端的长度；根长为根中最长的根的长度；干重为105℃杀青15 min后,70℃烘干至恒重的重量[22]。

1.3 统计分析

采用Excel 2003和统计软件DPS 7.05[27]进行数据处理和统计分析(包括方差分析、相关分析、隶属函数分析、聚类分析和广义遗传力的估算)。由于形态指标的相对值能够消除无性系间固有的遗传差异,比绝对值更能准确反映出无性系间耐盐能力的差异,因此,统计分析均使用各处理的相对值[28-29](以下简称“相对值”):

1.3.1 耐盐综合评价D值的计算 运用模糊数学隶属函数法对相对值进行标准化处理[30-31],公式为:

式中,X(ij)表示i基因型j指标的隶属值；Xij表示i基因型j指标的测定值；Xjmax、Xjmin分别表示j指标的最大值和最小值。

权重确定采用标准差系数法,用公式(3)计算标准差系数Vj,公式(4)归一化后得到各个形态指标的权重系数Wj:

二倍体马铃薯杂种无性系的耐盐综合评价D值计算公式为:

1.3.2 聚类分析方法 分别利用芽长、芽鲜重、芽干重、根长、根鲜重和根干重6个形态指标相对值和综合评价D值,对166个无性系(2个亲本+164个后代)进行聚类分析,聚类距离为欧氏距离,聚类分析方法为离差平方和法。

1.3.3 广义遗传力(h2)估算公式 以无性系平均值为单位,广义遗传力估算公式为:

2 结果与分析

2.1 NaCl胁迫下亲本和PHU-STN杂种后代的耐盐表现

由表1可知,NaCl胁迫处理下,无性系间的芽长、芽鲜重、芽干重、根长、根鲜重和根干重相对值均存在极显著差异。亲本和后代无性系的生长均受到不同程度的抑制,表现为芽长和根长变短,根数变少或部分无性系的根长变短,一些盐敏感无性系甚至不能生出新的叶芽。除根长相对值的平均值外,各后代无性系其他5个形态指标相对值的平均值均＜34,后代无性系的根长相对值平均值较高,为62.5。盐敏感亲本的6个形态指标的相对值的均明显低于耐盐亲本(根长相同)；PHU-STN杂种后代群体6个形态指标的相对值的最小值均小于盐敏感亲本(根长相同),最大值均大于耐盐亲本,且无性系间的6个形态指标相对值的差异均极显著；6个形态指标均表现出较高的广义遗传力(均大于0.85),其中芽长的广义遗传力最高,达0.931 1,根干重的广义遗传力最低,为0.860 8。

2.2 NaCl胁迫下PHU-STN杂种无性系耐盐性综合评价

由表2可知,芽长、芽鲜重、芽干重、根长,根鲜重和根干重相对值最大的无性系分别为A255、A108、A038、A014、A117和 A096。根据单一指标对亲本和164个无性系耐盐性强弱排序结果表现出不同程度的差异,芽长、芽鲜重、芽干重、根长、根鲜重和根干重对各无性系耐盐性贡献率的权重系数分别为 0.151 8、0.269 3、0.096 2、0.138 1、0.167 8 和 0.176 9。将隶属函数值与权重系数复合运算得到各无性系耐盐性的综合评价D值,D值越大,耐盐性越强。筛选出A108、A038、 A024、 A002、 A152、 A096、 A003、 A013、 A200、A053、 A066、 A231、 A139、 A016、 A120、 A233、 A254、A100、A255、A072、A050、A117、A238、A107、A069 和A167共26个无性系的D值高于耐盐亲本472-1。由表 3 可知,A077、A229、A106、A080、A153、A103、A032、A094、A115和A262共10个无性系的D值低于盐敏感亲本270-2,这些无性系是进行马铃薯耐盐性遗传学研究和耐盐新品种选育的重要种质资源。

表1 NaCl胁迫下亲本和后代形态指标值相对值Table 1 Relative value of morphological traits of parents and progeny under NaCl stress

2.3 6个形态指标及综合评价D值的相关分析

由表4可知,各个形态性状间均存在极显著的正相关。芽长与芽鲜重和芽干重的相关系数均较高,分别为0.83和0.76,芽鲜重与芽干重的相关系数最高,为0.92；根干重与芽鲜重(0.69)、芽干重(0.74)、根长(0.63)及根鲜重(0.59)的相关系数均大于0.5,其他性状间的相关系数均小于0.5；综合评价D值与6个形态指标相对值也均存在极显著的正相关,且相关系数均大于0.6,表明综合评价D值可以全面反映各无性系的耐盐性。

表4 6个形态指标相对值与D值的相关分析Table 4 Correlation between relative values of six morphological traits and D value

2.4 聚类分析

分别利用6个形态指标相对值和综合评价D值,对166个无性系进行聚类分析。由表5可知,2种方法均将166个无性系分为四个类群,但相同类群所包含的无性系存在差异,其中有一些无性系是被共同包含在同一类群的(表中加黑的无性系),第一类群中共同包含24个无性系,第二类群中共同包含36个无性系,第三类群中共同包含51个无性系,第四类群中共同包含24个无性系。由表6可知,第一类群到第四类群的每个形态指标相对值的平均值呈由大到小的顺序排列,因此,第一类群为强耐盐组,第二类群为中耐盐组,第三类群为弱耐盐组,第四类群为盐敏感组。此外,第一类和第二类群相比,根长相对值平均数的差异较小,说明与芽长、芽鲜重、芽干重、根鲜重和根干重相比,根长并非理想的形态筛选指标。综上,在进行耐盐筛选工作中,若无可参考对照,可以考虑用2种方法分别聚类,然后筛选出在同一类群中共同包含的无性系,以便提高筛选的精确性。

表5 各无性系在不同类群中的分布Table 5 Distribution of clones in different clusters

表6 不同类群中各无性系6个形态指标相对值的平均值Table 6 The average of relative values of six morphological traits of clones distributed in different clusters

3 讨论

由于单一的形态指标所反映的各无性系间的耐盐性强弱通常具有一定的局限性,只有通过对多项指标进行综合评价才能客观评价各无性系耐盐性的强弱[30]。目前运用较为广泛的抗逆性综合评定方法为隶属函数法,如戴海芳等[13]利用出芽率、幼苗鲜重等11个指标的隶属函数值评价了17个棉花品种的耐盐性；潘俏等[33]利用株高、根长等13个指标的隶属函数值评价了12个黄瓜耐盐突变体的耐盐性；张会丽等[8]利用产量、K+/Na+等20个指标的隶属函数值评价10个玉米品种的耐盐性；张巧凤等[34]根据芽期相对盐害指数及苗期相对根长的隶属函数值评价了24份小麦种质资源的耐盐性。本研究利用芽长、芽鲜重、芽干重、根长、根鲜重和根干重6个形态指标的隶属函数值综合评价了164份二倍体马铃薯无性系的耐盐性。由于试验材料数量较多,仅测定了6个形态指标,在后续的研究中,可以通过测量多个生理指标对已筛选出的26个耐盐无性系和10个盐敏感无性系的耐盐性进行更精确的评价。

本研究中,后代无性系根长相对值的平均值为62.5,其中有5个无性系的根长相对值高于100,最大值为124.2。在测量过程中发现,芽长值大的无性系多表现为根数也多,但根长并不一定长,而芽长值小的无性系多表现出根数很少,而根长却很长,说明盐胁迫抑制盐敏感无性系长出更多的根,耐盐无性系可以通过较多的根吸收营养以维持生长,而盐敏感无性系受盐胁迫不能长出更多的根,只能通过根的变长来吸收营养,这与郭建荣等[35]和谷俊等[36]的研究结果一致。此外,聚类分析结果表明,第一类群和第二类群的根长相对值的差异较小,也说明根长可能不是理想的形态筛选指标。因此,今后在组织培养条件下对马铃薯无性系进行耐盐性评价时,可以考虑用主根数代替根长,作为耐盐筛选的形态指标之一。

对于像马铃薯这样的无性繁殖作物来说,性状的广义遗传力对于育种选择具有重要的指导意义,因为从获得杂交种子起,无论基因型是否纯合,由于其无性繁殖特性,都不再分离,因而在分离的群体中进行选择是有效的[37]。另外,如果二倍体马铃薯能够产生未减数花粉(即2n花粉),且是第一次分裂重组型(firstdivision restitution,FDR),在 4x-2x杂交组合中,可以将二倍体马铃薯约80%的异质性传递给其四倍体后代[38],表明,估算研究性状的广义遗传力,在4x-2x杂交育种中具有重要意义。本研究中,在NaCl胁迫下所估算6个形态指标的广义遗传力值均大于0.85,说明NaCl胁迫下这几个性状主要由遗传因素控制,受环境影响较小,与前人研究一致[37,39-40]。因此,在今后的工作中,可以将耐盐性强的无性系移栽至大田,待开花后,检测是否产生2n花粉。有2n花粉的无性系,可通过4x-2x杂交将耐盐基因转移至四倍体栽培种中,拓宽现有马铃薯种质资源的耐盐遗传背景,从而为选育出耐盐性强的四倍体栽培品种奠定基础。

4 结论

本研究筛选出26个耐盐无性系和10个盐敏感无性系；形态指标和综合评价D值2种方法均将166个无性系分为4个类群；根长不是理想的形态筛选指标,后续研究可用主根数替代根长,作为耐盐筛选的形态指标之一。今后的研究可利用筛选出的无性系进行耐盐盆栽试验,进一步更准确地评价其耐盐性,以用于耐盐育种。本研究结果为快速评价大量马铃薯种质资源的耐盐性和马铃薯耐盐育种提供了理论依据和材料基础。