一株形似桑黄野生真菌的分离、培养及鉴定

周洪英 孙 波 罗 帷 胡 柏 吴洪丽*

(1.湖北省农业科学院经济作物研究所，武汉 430064；2.武汉设计工程学院食品与生物科技学院，武汉 430205)

桑黄为名贵传统中药，在中国、韩国等国家广受关注[1-2]。桑黄是一类桑黄属真菌的统称，桑黄属是最重要的药用真菌属之一，现有13个种，属于锈革孔菌目，寄生于赤杨皮、胡桃、忍冬、桑属、杨树、栎属、紫丁香属植物和锦带花上，具有抗癌、抗氧化、抗炎、降血糖、护肝等效果[2]。由于桑黄种及其宿主植物种的多样性，且桑黄子实体形态学特征与相似物种的差异不明确，加上桑黄本身极高的价值和关注度，将桑黄与其形似物种区分开来显得十分重要。

形态学鉴定与分子鉴定相结合，能有效进行微生物鉴定分类。本研究采集到一株形似桑黄野生真菌(LH02)，对其子实体进行组织分离得到纯培养分离株，进行转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)序列分析，结合形态学特征鉴定与分类。

1 材料方法

1.1 供试菌株及聚类用参考菌株

LH02，湖北省武汉市洪山区南湖边柳树上采集；

SH01，本室分离保存，经鉴定为桑树桑黄(Sanghuangporussanghuang)；

Sanghuangporusvaniniivoucher Dai8236,GenBank: MF772812.1

SanghuangporuspilatiiBRNM 771989, GenBank: KT428764.1

SanghuangporusquercicolavoucherDai 13947, GenBank: KY328309.1

SanghuangporussanghuangvoucherCui 14419, GenBank: MF772789.1

SanghuangporuslonicericolaDai8376, GenBank: JQ860308.1

SanghuangporusligneusMG13, GenBank: KR073082.1

SanghuangporusbaumiiDai16900, GenBank: MF772785.1

SanghuangporuszonatusCui8327, GenBank: JX069837.1

SanghuangporusalpinusvoucherCui124 85, GenBank: MF772781.1

Sanghuangporusweigelaevoucher Dai16 077, GenBank: MF772794.1

Sanghuangporuslonicerinusvoucher Dai 17095, GenBank: MF772787.1

Sanghuangporusmicrocystideusvoucher O 915609, GenBank: KP030787.1

SanghuangporusweirianusstrainCBS 618.89, GenBank: AY558654.1

Tropicoporusrudisvoucher O 915617, GenBank: MH101016.1

Tropicoporuslinteusvoucher JV 0904/64, GenBank: JX467701.1

Tropicoporusguaracastensisvoucher O 19228, GenBank: KP030794.1

TropicoporuspseudolinteusJV 0402/35-K, GenBank: KC778781.1

TropicoporussideroxylicolaJV 0409/30-J, GenBank: KC778782.1

Inonotusgriseusvoucher Dai 13436, GenBank: KX674583.1

Inonotushenanensisvoucher Dai 13157, GenBank: KX674581.1

Funaliatrogiiisolate XSD-37, GenBank: EU273516.1

Coriolopsistrogiistrain IFP 00751, GenBank: MG779615.1

Fomestruncatosporusisolate NW514, GenBank: EU622258.1

Alternariabokuraistrain 32, GenBank: FJ467353.1

1.2 培养基

PDA液体培养基：马铃薯洗净去皮挖芽，切成玉米粒大小颗粒，称取200 g加水1 000 mL熬煮，水沸后20～25 min，双层纱布过滤取滤汁定容至1 000 mL，加入葡萄糖20 g，pH自然。

PDA固体培养基：PDA培养基中添加1.5%琼脂粉。

1.3 菌株的分离培养

无菌条件下，用接种针取子实体内部组织，转至PDA平板中28 ℃培养7 d，观察平板上的菌落形态，再取少量菌丝接种于PDA液体培养基，摇床28 ℃，120 r/min培养至长出菌丝球。

1.4 DNA抽提，PCR和测序

取液体培养菌丝球液氮研磨，CTAB法抽提总DNA[3]，通用引物ITS5(GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG)、ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)用于扩增ITS rDNA及扩增产物测序。PCR在30 μL含2×Es Taq MasterMix的反应体系中进行，反应体系及PCR条件见产品说明书。PCR产物交测序公司测序。

1.5 序列比对和聚类分析

测序结果使用Seqman软件拼接矫正不一致碱基，所得ITS序列与NCBI Nucleotide数据库比对，将比对结果中序列一致性最高的菌株、SH01、桑黄属内13个种及其近缘种属菌株[2]ITS序列作为参考，用CLUSTAL W软件[4]比对LH02及参考菌株序列，MEGA软件[5]邻接法(neighbor-joining，NJ，bootstrap 1000)构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定

野生LH02寄生于柳树上，桑树桑黄SH01寄生于桑树上。LH02子实体与野生桑黄子实体形态类似(图1A-C)。

A-野生LH02子实体形态，寄生于柳树上；B/C-野生SH01子实体形态，寄生于桑树上；D-LH02菌落为乳白色，菌丝体茂密粗壮，生长速度较快；E-SH01菌落为淡黄色，菌丝体稀释纤细，生长速度一般。

图1 LH02与SH01形态比较

LH02菌盖表面为黄棕色至棕色，多年生老熟子实体菌盖则为棕褐色，无菌柄，菌盖木质化，还具有反复生长停顿形成的年轮状结构，呈扇形、马蹄形等。

LH02、SH01经过琼脂培养基上培养后观察比较菌落，菌落形态及特性差异明显(图1D-E)。LH02菌落呈圆形、微凸光滑、湿润、颜色为乳白色，菌丝体茂密粗壮，生长速度较快；SH01菌落呈圆形、微凸光滑、湿润、颜色为淡黄色，菌丝体稀疏纤细，生长速度较慢。

2.2 ITS序列分析

LH02的ITS测序结果提交NCBI GENBANK注册，索取号MN726442。将LH02及SH01等参考菌株的ITS序列聚类进行系统发育分析(图2)，结果表明LH02与SH01等桑黄属及其近缘真菌亲缘关系较远，与C. trogii IFP 00751亲缘关系最近，是革孔菌属(Coriolopsis)真菌。

图2 基于ITS序列构建的LH02及桑黄等参考菌株系统发育树

3 讨 论

桑黄的药用价值最先在中医典籍中得到肯定，《神农本草经》《本草纲目》等多个中药典籍中均有记载。近代研究显示，桑黄对肿瘤抑制效果显著，已成为国际公认的最有效的抗癌真菌，其突出的抗肿瘤功效在日韩等国家备受关注，同时还有抗氧化、抗炎、降血糖、护肝等效果[6-7]。然而在掠夺性开采下，野生资源日渐枯竭，人工驯化成功的品种和产量又极其有限，加之桑黄本身又极具价值，于是大量桑黄的形似真菌、近缘真菌涌入市场，功效参差不齐，为从业人员和消费者带来困扰，也极大限制了桑黄产业的发展。区分桑黄及其形似真菌、近缘真菌，成为桑黄属真菌资源开发利用中急需解决的一个问题。

多孔菌科真菌子实体缺乏明显的组织器官分化，颜色、大小等性状易受环境、生长时间等因素影响，依据子实体形态进行分类鉴定有很大不确定性。实验室环境下菌丝体和菌落形态相对较稳定，ITS、28S rDNA等保守基因序列更为稳定可靠。本研究结合子实体外形、菌丝体性状、菌落形态比较及ITS序列聚类分析，将柳树上寄生的一株野生多孔菌与桑黄属真菌区分开来，该方法可为桑黄属菌株的鉴伪工作提供参考。

此外，很多桑黄属之外的多孔菌也有抗癌活性[8]，有深入研究的价值，需投入更多科研力量揭示这类真菌的功能和活性。