复杂基质中短链氯化石蜡前处理方法的建立和优化

高 姗， 李慧娟， 陈相峰， 吕瑞敏*

(1.山东省分析测试中心 齐鲁工业大学(山东省科学院)，山东济南，250014; 2.山东师范大学 生命科学学院，山东济南，250014)

氯化石蜡(CPs)是一种复杂的多氯代正构烷烃混合物[1]。CPs由于具有化学稳定性、电绝缘性、阻燃性、耐火性等优点，已被广泛应用于润滑剂、金属切削液以及塑料中的阻燃剂等。CPs可以根据其碳链长度的不同分为：短链氯化石蜡(SCCPs，C10-C13)、中链氯化石蜡(MCCPs，C14-C17)和长链氯化石蜡(LCCPs，C18-C30)[2]。SCCPs是非常复杂的混合物，能够在环境中持久存在，且具有较强的生物毒性和生物累积性，并能通过长距离大气传输造成全球性污染，所以在2017年5月SCCPs被列入斯德哥尔摩公约附件A受控持久性有机污染物(POPs)清单。SCCPs的组成和结构非常复杂[3]，分析时易受其它氯化合物的干扰，因此在样品前处理以及准确定量分析等方面仍然存在着较大的挑战。目前对SCCPs的前处理方法主要有以下几种：固体样品主要采取加速溶剂萃取、超声提取和索氏提取等；液体样品主要采取固相萃取、液-液萃取和固相微萃取等[4]。但氯苯、多氯联苯等有机氯类污染物广泛存在于环境中，会对SCCPs的定性和定量分析造成干扰，这些干扰物质的浓度往往远大于待检测目标化合物的浓度，因此，经萃取完的样品的净化处理也非常重要。Reth等[5]使用硅胶柱对北海和波罗的海鱼类样本进行净化处理，结果表明仍有32%的α-六氯环乙烷残留。Thomas等[6]使用Florisil柱对人乳脂肪样本进行净化处理，效果仍不甚理想。因此，需要优化SCCPs的净化处理方法，达到尽可能多的去除干扰杂质的目的。

鉴于SCCPs的POPs特性以及对人体健康造成的潜在风险，多个国家已明令禁止生产和限制使用SCCPs[7 - 9]。SCCPs的毒性较中长链产品大，所以在最近几年受到了广泛的关注。目前已经在不同区域、不同环境介质中检测到SCCPs[10]。我国对CPs的生产和使用量居世界首位，因此，有必要对SCCPs在食品领域的污染状况进行系统性研究。本文对SCCPs在复杂介质中的提取方法进行了对比研究，并优化了SCCPs的净化处理方法，在此基础上建立了气相色谱-电子捕获负离子化-低分辨质谱(GC-ECNI-LRMS)的仪器分析方法，并用该方法对我国济南地区食品样品中SCCPs总量和同系物组成进行了初步研究。

1 实验部分

1.1 主要仪器及试剂

7890A气相色谱-7000B三重四极杆CI离子源质谱联用仪(美国，Agilent)；Dionex ASE 350加速溶剂萃取仪(美国，Thermo Fisher Scientific)；Multifuge X1R高速冷冻离心机(美国，Thermo Fisher Scientific)；NAI-DCY-12Y氮吹仪(上海那艾精密仪器有限公司)；FD -1A-50冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)；Supelco-EA固相萃取仪(美国，SUPELCO)。

标准品：SCCPs(氯含量51.5%、55.5%和63.0%)、ε-六氯环己烷(ε-HCH，10 ng/μL)购自Ehrenstorfer GmbH(德国Augsburg)。内标13C10(100 ng/μL，溶于壬烷，纯度99%)购自Cambridge Isotope Laboratories(美国Andover)。环己烷、二氯甲烷、正己烷均为色谱纯(美国TEDIA公司)。无水Na2SO4(分析纯)、浓H2SO4(优级纯)(国药集团化学试剂有限公司。硅胶(0.063～0.1 mm)、弗罗里硅土(0.150～0.250 mm)(德国Merck公司和CNW公司)。实验用水为超纯水。

1.2 萃取方法

本研究优化了常用的固体基质和液体基质中SCCPs的前处理方法，对比研究了加速溶剂萃取、超声萃取、固相萃取和液-液萃取的萃取效率。土壤样品采集后，冷冻干燥，研碎并过80目筛。将制备好的样品放入马弗炉中，经600 ℃灼烧12 h作为空白基质。

1.2.1 加速溶剂萃取称取5 g样品于萃取池中，加入11 g无水Na2SO4并混匀，然后加入5 μL SCCPs标准品(氯含量51.5%、55.5%、63.0%)和5 μL13C-反式氯丹作为回收率内标，以二氯甲烷∶正己烷(1∶1,V/V)作为萃取溶剂，在萃取温度为100 ℃，萃取压力保持在1.1 MPa以上，加热时间为5 min，静态时间为10 min，循环三次，冲洗体积60%，吹扫时间60 s。

经加速溶剂萃取后的萃取液，转移至100 mL鸡心瓶中，旋转蒸发浓缩至1～2 mL。其中水浴锅温度为50 ℃，循环冷却水温设置为10 ℃，转速为75 r/min,系统初始压力为90 kPa。在每个样品旋转蒸发前，均需要先旋转蒸发30 mL二氯甲烷，以达到清洗仪器的目的，避免交叉污染。再将旋转蒸发浓缩液转移至K-D管中，用正己烷润洗转移2～3遍，然后氮吹浓缩至100 μL，转移至装有玻璃内衬管的进样小瓶。在进行仪器分析前加入5 μLε-HCH作为内标，并振荡混匀，每次做6个平行实验。

1.2.2 超声萃取称取5 g样品于50 mL离心管中，加入5 μL SCCPs标准品(氯含量51.5%、55.5%、63.0%)和5 μL13C-反式氯丹作为回收率内标，然后加入15 mL正己烷和15 mL二氯甲烷作为提取液。振荡混匀后超声20 min，再以10 000 r/min离心10 min(温度为25 ℃)。取上清液于100 mL鸡心瓶中，循环三次。将超声萃取后的萃取液旋蒸浓缩，以下步骤同1.2.1项。

1.2.3 固相萃取用1 L水作为空白基质，然后加入5 μL SCCPs标准品(氯含量51.5%、55.5%、63.0%)和5 μL13C-反式氯丹作为回收率内标。首先用3 mL正己烷、3 mL甲醇和3 mL水对Welchrom C18E小柱进行预淋洗和活化。将1 L水过Welchrom C18E小柱，流速为6 mL/min。上样完毕后弃去滤液，再用3 mL 10%正己烷溶液进行淋洗，以除去非极性干扰物质。最后用3 mL正己烷∶二氯甲烷(1∶1，V/V)进行洗脱。洗脱液旋蒸浓缩，以下步骤同1.2.1项。

1.2.4 液液萃取选用1 L水作为空白基质，并向其中加入5 μL SCCPs标准品(氯含量51.5%、55.5%、63.0%)和5 μL13C-反式氯丹作为回收率内标。将1 L水加入到分液漏斗中，再加入50 mL二氯甲烷，摇匀。待液体分层后，将下层有机相转入到150 mL鸡心瓶中，循环三次。最后向鸡心瓶中加入10 mL正己烷，将提取液旋蒸浓缩，以下步骤同1.2.1项。

1.3 仪器条件

气相色谱采用HP-5MS毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，氦气作为载气，恒流模式，载气流速为：36 cm/s，CH4做反应气。柱箱初始温度为100 ℃，保持1 min，然后以30 ℃/min升至160 ℃，恒温5 min，最后以30 ℃/min升至310 ℃，恒温7 min，总分析时间为20 min。进样口温度250 ℃，不分流模式进样1 μL。质谱采用电子捕获负离子源离子化(ECNI)技术，以选择离子监测(SIM)模式对SCCPs的特征离子进行检测。离子源温度200 ℃，传输线温度275 ℃。

1.4 定性和定量

参照Reth等报道的方法[11]，选择最大丰度的[M-Cl]-作为定量离子，次要丰度的[M-Cl]-作为定性离子。为了提高灵敏度，每一个样品进样4次，依次扫描C10、C11、C12和C13的同类物。具体的扫描离子、扫描积分的离子如表1所示[12]。应用的SCCPs定量方法参照Reth和Oehme等人[13]建立的氯化度和总响应因子的线性关系曲线。运用该方法，在基质样品和参考标准品氯化度不同的情况下也能得到的比较可靠的定量结果。

表1 GC-ECNI-LRMS测定SCCPs离子信息

1.5 质量保证与质量控制

实验中采取严格的质量控制和质量保证措施以确保定量结果的准确性。所有样品前处理的过程都是在实验室洁净通风柜中进行。玻璃器皿在DECON 90的中性洗涤溶液中浸泡超过6 h，然后用水洗涤至少6次。玻璃仪器在使用前在高温450 ℃烘烤4 h以上，然后用二氯甲烷润洗两遍后使用。每批次样品中包含1个程序空白。总体上，空白样品中CPs的水平处于接近或低于检测限。在信噪比为3∶1时，仪器检测限为0.2 ng。

2 结果与讨论

2.1 萃取方法的优化和回收率

使用加速溶剂萃取和超声萃取法对空白土壤基质进行萃取，回收率分别为94.6%和63.4%。标准偏差分别为1.59%和1.63%。针对固体基质，加速溶剂萃取回收率高于超声萃取法，并且加速溶剂萃取具有有机溶剂用量少、使用方便、安全性高，重现性好等优点。使用固相萃取和液-液萃取法对水基质进行萃取，回收率分别为70.2%和57.1%。标准偏差分别为2.98%和4.40%。针对液体基质，固相萃取回收率略高于液液萃取法。同时固相萃取可以同时完成样品的富集与净化，提高了检测灵敏度，重现性好。不过固相萃取法的回收率远低于加速溶剂萃取法的回收率。不同萃取方法回收率数据表见表2。

表2 不同萃取方法回收率数据表

2.2 复合层析柱净化效果

分别采用弗罗里硅土和硅胶层析柱分离纯化不同基质中的SCCPs。将5 μL SCCPs标准品(氯含量63.0%)和5 μL13C-反式氯丹作为回收率内标混合后,分别加入弗罗里硅土层析柱，硅胶层析柱以及复合弗罗里硅土-硅胶层析柱，考察不同层析柱对SCCPs主要干扰物质如PCBs、氯苯和有机氯农药等的去除效果。层析柱分离纯化SCCPs洗脱程序为:首先用50 mL正己烷淋洗层析柱，去除脂类化合物和PCBs、氯苯等有机氯农药；然后用100 mL正己烷∶二氯甲烷混合溶液(1∶1，V/V)进行洗脱，洗脱液中主要是SCCPs，用鸡心瓶接收此部分洗脱液，浓缩定容后进行分析。研究结果表明，仅用单个弗罗里硅土和硅胶层析柱分离，其净化效果不理想，复合弗罗里硅土-硅胶层析柱能很好的分离SCCPs和其它的未知杂质。SCCPs在复合层析柱上的回收率在80.2%～92.2%，13C10-反式氯丹的回收率为76.4%～89.8%。

图1 氯化度和总响应因子的线性关系Fig.1 Linear relationship between the total response factor and calculated chlorine content

2.3 标准曲线的建立

三种SCCPs标准品(氯含量为51.5%、55.5%和63.0%)用于配制标准曲线系列溶液。将51.5%和55.5%的SCCPs标准品混合(1∶1，V/V)以产生53.5%的溶液，以及55.5%和63%的混合物(59.25%)，55.5%和59.25%的混合物(57.375%)，59.25%和63%的混合物(61.125%)。通过气相色谱-质谱检测了7种不同氯含量的SCCPs混合物，结果如图1所示。

2.4 样品分析结果

将所建立的SCCPs分析方法用于对食品样品的前处理和检测，在所有的食品样品中均能检测到SCCPs。食品样品中SCCPs的色谱图如图2所示。SCCPs的浓度范围为8.27～268 ng/g湿重，平均值为69.3 ng/g湿重。动物源性食品样本中SCCPs的浓度高于植物源性食品样本中SCCPs的浓度。SCCPs的同系物主要以C10和Cl7同族体为主，这不同于商业品CP-52的同族体组成特征。该结果表明，超市食品没有被商业CPs产品直接污染。

图2 食品样品中SCCPs的色谱图Fig.2 Chromatograms of SCCPs in food samples

3 结论

本研究比较了常用的固体基质和液体基质中SCCPs的样品前处理方法，结果表明对于固体基质，加速溶剂萃取的萃取效果优于超声萃取法，适用于固体样品中SCCPs的提取。对于液体基质，固相萃取法回收率高于液-液萃取的回收率，并且固相萃取法省时省力，重现性好。净化层析柱填料优化结果表明，利用弗罗里硅土-硅胶复合柱净化可以达到理想的效果，能很好地去除复杂基质中的干扰组分。本研究选择加速溶剂萃取，复合层析柱净化，结合气相色谱-电子捕获负离子-质谱分析技术，建立了食品基质中SCCPs的前处理和定量分析方法。该方法对食品样品前处理重复性较好，回收率较高，能够进行实际样品中SCCPs的分离分析。