辅助T细胞亚群分化调控机制研究进展①

张笑梅 刘春燕 邵宗鸿

(天津医科大学总医院血液科，天津 300052)

在过去20年里，Th亚群家族不断扩大，目前包括Th1、Th2、Th9、Th17、滤泡辅助性T细胞(Tfh)、调节性T细胞(Treg)和Th22细胞。这些亚群主要由每个亚群表达的细胞因子、转录因子、表观遗传修饰及代谢等复杂的调控网络参与诱导。原始CD4+T细胞分化在很大程度上取决于与淋巴器官树突状细胞(DCs)的相互作用，其中细胞因子在Th细胞分化的早期阶段起着重要的监管作用；为了更好地了解CD4+T细胞分化的复杂机制，有必要了解在分化过程中的转录因子结合谱，讨论T细胞分化中的转录因子,包括 STAT蛋白,主调控因子及 IRF4复合物等；表观遗传调控指的是不改变DNA序列通过DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA介导的调控等多种修饰而改变基因表达的行为。越来越多的证据表明表观遗传修饰能够通过与转录因子之间的合作来确定不同亚群T细胞的分化；另外为适应环境应缴源，T细胞进行代谢重塑，通过调整其细胞代谢，来调节淋巴细胞信号传导，并影响其分化和功能，如发育或分化、细胞因子的产生和细胞迁移。因此，本文旨在总结目前关于Th细胞亚群在细胞因子、转录因子、表观遗传学及代谢水平上发育和分化的分子调控知识，阐明Tfh细胞生物学，探讨不同亚群分化造成的免疫功能紊乱而引起的自身免疫性疾病及相关药物研发进展，为今后的临床干预提供潜在靶点。

1 T细胞亚群分化机制

1.1Th1细胞分化机制

1.1.1细胞因子 Th1细胞主要产生IFN-γ帮助宿主防御细胞内病原体(包括病毒、细菌)。IL-12通过上调T-bet使得原始CD4+T细胞向Th1方向发展；同时，IL-12激活STAT4，活化的STAT4与T-bet结合促进INF-γ产生。研究表明，由于IL12B(编码IL-12p40亚单元，如IL-12和IL-23)、IL12RB1(编码β1链作用于IL-12和IL-23受体)、IRF8(与产生IL-12的树突状细胞有关)和ISG15(与IL-12协同作用的分子)突变，受试者缺乏功能性IL-12和/或IL-12受体的表达，导致Th1细胞传代严重受损[1]。INF-γ是Th1细胞产生的主要细胞因子，INF-γ通过STAT1激活进一步促进T-bet的表达，形成正反馈回路，共同促进Th1细胞的分化[1]。INFγ-STAT1-T-bet通路是促进Th1体外分化的一种强有力的扩增机制。IL-2也参与调节Th1细胞分化[2]，它通过诱导IL-12Rβ2链(IL-12受体的组成部分，增强对IL-12的反应)的表达导致Th1分化；IL-2也上调Tbx21的表达，从而稳定Th1系[3]。

1.1.2转录因子 T-bet是参与Th1分化的主要转录因子，其表达同时受TCR、IFN-γ和IL-12R信号转导途径的控制。T-bet能够促进IFN-γ表达，同时抑制Th2、Th17细胞分化。与促进Th1细胞分化相比，T-bet分别通过抑制GATA3和RORγt的功能来抑制Th2和Th17的分化[4]。同时T-bet可以与其他转录因子形成复合物，进一步增强Th1基因的表达。T-bet可以与Bcl-6形成抑制复合物，通过负调控Socs1、Socs3和Tcf7促进Th1细胞发展[5]；此外，T-bet与runt相关转录因子3(RUNX3)协同诱导Ifng表达，同时抑制Th1细胞中Il4表达；T-bet与RUNX1相互作用，阻止RUNX1与RORγt结合从而抑制Th17分化[5]；T-bet能够诱导HLX(一种同源框蛋白)并与之相互作用促进Th1细胞表达IFN-γ。T-bet本身并没有抑制Tfh细胞分化的功能，但它可以降低Tfh对B细胞提供辅助功能的作用。另外，STAT1和STAT4也是参与Th1分化的重要转录因子，它们分别被IFN-γ和IL-12激活，诱导Tbx21基因，编码T-bet，T-bet进一步驱动Th1分化，促进IFN-γ表达，从而形成正反馈循环。

1.1.3表观遗传修饰 表观遗传修饰可以通过DNA甲基化调节Th1细胞因子表达来指导Th1细胞分化。IFN-γ基因位点可实现DNA去甲基化和组蛋白H3乙酰化或三甲基组蛋白H3赖氨酸4(H3K4me3)等修饰，T细胞免疫球蛋白和黏蛋白域蛋白3(TIM-3)偶尔在Th1细胞中发现，提示一些潜在 机制可能与TIM-3和Th1细胞有关。DNA甲基化分析确定TIM-3启动子内的CpG岛受DNA甲基化的调控。体外诱导分化的Th1细胞在TIM-3启动子的特定区域均表现出DNA去甲基化，提示TIM-3启动子区域编码的某些基因表达增加，促进了Th1细胞的分化[6]。新近研究生长因子独立性1(Gfi1)在Th1细胞中的作用，发现与Th1相关的转录因子Gfi1呈负相关。Gfi1与Th1细胞的转录因子结合，使得与基因抑制密切相关的组蛋白H3K4甲基化表达降低[7]。Dicer是获得成熟miRNA所必需的RNaseⅢ酶，在缺乏Dicer的Th细胞中，IFN-γ和T-bet的强烈分泌表明miRNAs在分化阶段起负作用。miR-29在原始T细胞中的表达增加，对Th1细胞的分化有明显的抑制作用，miR-29a在转基因小鼠中的表达降低可提高血清IFN-γ水平，提示miR-29a通过调节IFN-γ mRNA的表达而发挥作用。

1.1.4代谢调节 CD4+T细胞向效应细胞的激活和分化伴随着从氧化磷酸化到糖酵解的代谢转变。有氧呼吸在Th1 CD4+T细胞功能中的重要性也通过CD4+T细胞中乳酸脱氢酶(LDHA)的缺失得到了证实，激活的细胞调控其新陈代谢水平回到氧化磷酸化水平，随后通过影响组蛋白乙酰化来降低IFN-γ产生。从糖酵解到氧化磷酸化的转变使乙酰-CoA进入TCA途径,从而减少可用性的组蛋白乙酰化作用和激活IFN-γ位点[8]。Th1 CD4+T细胞对糖酵解的依赖减少了通过线粒体氧化磷酸化(OxPhos)产生的有害ROS的累积。虽然CD4+T细胞激活需要较低水平的活性氧，但长期暴露于活性氧会通过改变DNA修复和信号通路的成分导致细胞死亡[9]。Th1 CD4+T细胞的糖酵解和氧化能力也依赖于转录因子IRF4。在Th1 CD4+T细胞,IRF4缺失会导致GLUT3和己糖激酶2表达降低，同时降低IFN-γ+CD4+T细胞的表达[10]。在最近的一项研究中，CD4+T细胞的氨基酸代谢以及糖酵解和OxPhos依赖于ATF4，这是一种被氧化和内质网应激激活的转录因子[11]。ATF4缺乏症可以扰乱包括细胞ROS水平在内的多种途径。在体外Th1极化条件下,ATF4缺乏的CD4+T细胞在氧化还原、增殖分化、细胞因子产生方面存在缺陷，使得INF-γ降低；T-bet表达更低而Foxp3的表达更高[11]。在实验性自身免疫性脑炎(EAE)小鼠模型中，ATF4缺乏降低了Th1，但增加了Th17 CD4+T细胞的分化，导致疾病严重程度的增加[11]。

1.2Th2细胞分化机制

1.2.1细胞因子 Th2细胞参与对细胞外寄生虫包括蠕虫的过敏反应和宿主防御[12]，能够产生IL-4、IL-5、IL-6和IL-13等细胞因子。Th2细胞的分化是在IL-4存在下通过TCR刺激诱导的。IL-4是参与Th2细胞分化的主要细胞因子，它通过阻断IL-12和IFN-γ来增强Th2分化。同时，IL-4激活STAT6进而诱导GATA3表达，可以促进Th2细胞分化，也有助于维持Th2表型。在大部分CD4+T细胞亚群中，IL-2的作用是促进增殖，而在Th2细胞中，IL-2在驱动原始T细胞向Th2细胞分化中起着重要的驱动作用，IL-2激活STAT5信号通路，通过调节TCR诱导的IL-4Rα表达，进而调节Th2细胞的早期分化。在体外Th2细胞分化8 h内，与Il4ra位点结合的STAT5A和STAT5B明显，通过诱导IL-4Ra的表达，增强IL-4的反应，导致IL-2到IL-4信号级联[2,13]。此外，IL-2促进STAT5A和STAT5B在Il4/Il13Th2细胞因子基因座的多个位点结合，从而增加Th2细胞的产生[13]。

1.2.2转录因子 GATA3是指导Th2细胞分化的主要转录因子，IL-4以STAT6依赖的方式诱导GATA3表达，GATA3进一步促进IL-4-IL-5-IL-13位点向开放构象发展。使得其他转录因子能够进入该位点参与Th2细胞分化。IL-4高水平表达和GATA3表达的自激活形成了正反馈回路，进一步诱导了GATA3的表达和Th2的分化。同时，GATA3诱导c-Maf表达，刺激c-Maf促进Th2分化[14]。STAT6作为参与Th2细胞分化的另一个重要的转录因子，在细胞因子IL-4的激活下诱导GATA3表达，进而促进Th2细胞分化；同时通过抑制STAT4表达和RUNX3介导的Ifng表达进而抑制Th1细胞标志性细胞因子IFN-γ转录。另外，其他转录因子也参与Th2细胞分化，转录因子DEC2在Th2细胞中表达，并通过与启动子结合来增强GATA3表达[15]。IRF4与NFATc2协同调控Il4基因表达，进而促进Th2细胞分化[16]。

1.2.3表观遗传修饰 DNA甲基化也可以通过调节Th2细胞因子的表达来指导Th2细胞分化。Th2细胞因子位点可获得抑制性组蛋白修饰和DNA甲基化。同样体外诱导分化的Th2细胞在TIM-3启动子的特定区域均表现出DNA去甲基化，提示TIM-3启动子区域编码的某些基因表达增加，促进了Th2细胞的分化[6]。Th2细胞分化受Il4位点组蛋白修饰和顺式调节元件的参与控制。组蛋白高乙酰化可能与记忆性Th1和Th2细胞中Ifng和IL4基因启动子区的开放染色质状态有关。大量研究报道了组蛋白H3乙酰化、Lys-4三甲基化(H3K4me3)和trithorax G(TrxG)在Th2细胞分化中的重要作用。TrxG复合物的产生是在GATA3启动子区激活STAT6时发生的。与Th1细胞相比，miRNA对Th2细胞分化的调控仍需进一步研究。研究证实了miR-21在T细胞体外促进Th2细胞分化的作用[17]，而在miR27或miR128的调控下，IL-4和IL-5的分泌减少[18]。

1.2.4代谢调节 活化的Th2 CD4+T细胞也依赖糖酵解进行分化并发挥功能。RhoA是Rho家族小分子量G蛋白的成员之一，具有GTP酶活性，与GTP结合作用于细胞内的效应因子，是Th2 CD4+T细胞糖酵解潜在的关键调节器。RhoA缺失T细胞使得Th2分化缺陷从而减少过敏性气道炎症，这与IL-4R、GATA3和磷酸化STAT6水平较低有关[19]。mTORC1通路也调节活化Th2 CD4+T细胞的糖酵解能力，但与Th1 CD4+T细胞不同，Rheb的缺失并没有减少Th2 CD4+T细胞的糖酵解[20]，相反，IL-4R、IL-2Ra和GATA3的表达减少证明了Raptor缺失的mTORC1抑制显著减少了Th2 CD4+T细胞的糖酵解，并削弱了Th2的分化[21]。但是当前研究对于糖酵解和相关调节因子如何影响Th2 CD4+T细胞相关的细胞因子、受体和转录因子的表达仍不清楚。

1.3Th9细胞分化机制

1.3.1细胞因子 Th9细胞作为辅助T细胞的一种亚型，能够产生IL-9，参与自身免疫性疾病、过敏性反应和抗肿瘤免疫[22]。原始CD4+T细胞在TGF-β和IL-4同时存在的情况下分化为产生IL-9的Th9细胞，而不产生其他Th2类细胞因子，从而发现TGF-β和IL-4在Th9细胞分化中发挥重要作用。其中IL-4是诱导Th9细胞最重要的一种细胞因子，IL-4通过下游转录因子如STAT6、PU.1和IRF4促进Th9细胞分化。在仅有IL-4存在的条件下，诱导原始CD4+T细胞向Th2细胞分化，IL-4联合TGF-β能够刺激原始CD4+T细胞向Th9细胞分化。而在IL-4缺失的情况下，TGF-β能够诱导其向Treg分化[23]。当IL-4与其受体结合，进而激活STAT6，促进BATF和IRF4表达[24，25]。TGF-β信号通路在Th9细胞中可诱导Smad活化和PU.1的表达[25]。IL-2也对Th9细胞的分化及IL-9的产生有重要作用，IL-2与受体结合后诱导STAT5的活化，从而促进Th9细胞的分化，阻断IL-2或抑制STAT5可导致IRF4和PU.1的表达下降，抑制Th9细胞的分化[24-26]。

1.3.2转录因子 PU.1和IRF4是参与Th9细胞分化的主要转录因子。ETS家族转录因子富含嘌呤盒1(PU.1)是Th9特异性转录因子[25]。PU.1通过与Il9启动子结合以及PU.1招募组蛋白乙酰转移酶调控Il9位点的染色质重构发挥调控作用[25],通过调节GATA3抑制Th2的表达，促进Th9的发育，PU.1缺失小鼠CD4+T细胞IL-9的产生会受到影响[27]。IRF4是Th2细胞中IL-4的作用靶点，同时对Th9的发育也有影响，IRF4与Il9基因直接作用，IRF4缺陷小鼠原始CD4+T细胞在Th9极化过程中抑制了IL-9的表达，而siRNA介导的IRF4沉默则减弱了IL-9的表达。AP-1家族成员BATF直接与Il9基因结合，表现出与IRF4的协同作用。在IL-4/STAT6信号缺失的情况下，IRF4的异位表达未能挽救IL-9的表达，提示了Th9细胞发育需要IL-4下游其他转录因子。另外STAT5与STAT6也是Th9分化的重要转录因子。最近IL-2-JAK-STAT5信号通路被证明对Th9分化至关重要。在Il9启动子上具有关键的STAT5结合位点，IL-2通过诱导STAT5与Irf4启动子结合，从而促进IRF4的表达；除IL-2，细胞因子TSLP也能激活STAT5，已经证实TSLP诱导Th9分化过程中活化STAT5的表达，从而导致IL-9的产生。STAT6在Th9发育中的作用已经确定：IL-4介导的STAT6激活通过抑制Foxp3和T-bet的表达来促进Th9发育，而Foxp3和T-bet则可以抑制IL-9的产生，STAT6也促进了IRF4表达，如上所述，IRF4促进Th9分化；磷酸化的STAT6还能促进GATA3表达，在缺少STAT6的情况下，IL-9的产生受到严重损害。

1.3.3表观遗传修饰 最近一项研究显示通过抑制甲基化诱导Th9特异性PU.1表达，相反，阻止组蛋白乙酰化降低IL-9诱导刺激后PU.1的表达，表明PU.1的表观遗传修饰在调节Th9分化方面是独特的[28]。Smad2或Smad4缺乏可导致T细胞IL-9表达受损，这可能是由于抑制染色质修饰组蛋白H3K27三甲基化和增强EZH2与IL-9细胞的结合所致[29]。最近的一项研究发现，ETS转录因子ETS变异体5(ETV5)需要在Il9基因启动子内富集组蛋白乙酰转移酶(HATs)来增强IL-9+Th9细胞。体外研究表明，在没有ETV5的情况下p300降低，同时IL-19启动子中富含组蛋白H3乙酰化和H4K16乙酰化[30]。

1.4Th17细胞分化机制

1.4.1细胞因子 Th17细胞作为辅助T细胞的一种亚型，能够介导抗真菌感染和细胞外细菌免疫。2006年首次报道小鼠CD4+T细胞在IL-6和TGF-β联合作用下表达IL-17。然而，人们发现这两种细胞因子组合不会诱导人类CD4+T细胞表达IL-17。通过TCR刺激TGF-β、IL-6、IL-23、IL-21、IL-1β及STAT3信号驱动诱导原始CD4+T细胞分化为Th17细胞产生标志性的细胞因子IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22以及GM-CSF[31]，促进免疫反应的发生，也易引起自身免疫性疾病[31，32]。在TGF-β和IL-6诱导下，初始Th17细胞发生极化。IL-23通过STAT3激活介导的IL-23受体信号进一步调节Th17细胞极化，为Th17细胞的维持、扩张和正常功能提供一个正反馈通路。近年研究发现，TGF-β在人类Th17细胞发育中确实发挥着至关重要的作用，TGF-β通过SMADS磷酸化诱导RORγt及原始T细胞、IL-23R和IL-1R表达，使其对IL-23和IL-1β敏感；IL-6与其受体IL-6R结合，激活STAT3信号通路和IL-21表达，然后IL-21和IL-6进一步维持RORγt和RORa表达所必需的STAT3信号通路，Foxp3的过表达导致IL-17A的表达降低，IL-6能够抑制Foxp3的表达，从而间接促进IL-17的表达。IL-21是Th17细胞分泌的一种效应细胞因子，它通过一个自放大环促进Th17的发育。相关研究表明，在STAT3激活的细胞因子中，IL-6在小鼠中占据主导地位，而IL-23在人类Th17细胞中发挥重要作用，IL-23在小鼠体内与Th17成熟为炎症细胞有关，既往研究表明，IL-2抑制小鼠体外及体内IL-17表达，其机制作用在IL-2-STAT5信号通路：①STAT5与STAT3竞争结合到IL17a基因位点上；②IL-2抑制IL-6受体表达；③IL-2促进T-bet表达，从而抑制RORγt的表达[33]。然而IL-2可以在体外促进人Th17细胞发育，此机制目前还有待研究[34]。

1.4.2转录因子 RORγt作为维甲酸相关孤儿核激素受体家族是Th17细胞的特异性转录因子。RORγt对Th17起主要调节作用，RORγt直接结合到IL-17A的启动子区域，从而调节其转录[35-37]。在RORγt缺失小鼠中IL-17的产生减少，但RORγt的表达本身不足以驱动Th17细胞分化，STAT3激活对IL-17和IL-21的正常表达至关重要[36，37]。在IL-6和TGF-β的共同作用下，STAT3被激活，激活的STAT3诱导RORγt的表达进而促进Th17细胞分化[38]。

1.4.3表观遗传修饰 IL-17A启动子区域的DNA在原始或Th1细胞中高度甲基化,这些细胞都与IL-17A的非活性状态一致[39]。许多研究都提到了DNA甲基化在维持Foxp3基因稳定表达与Treg细胞功能相关方面的关键作用。最近的研究表明，TET酶家族与TGF-β诱导的Treg细胞中Foxp3的长期表达呈正相关。某些特定分子(如Vitamin c)靶向TET酶，促进5mC氧化为5hmC，这与DNA去甲基诱导的Foxp3基因过表达密切相关[40]。Treg特异性去甲基化区(TSDR)是Foxp3基因的一个特征性片段。新的证据证明TSDR只能在稳定的Treg细胞表型中被检测到。研究还发现，自然Treg细胞中聚集了一个整体去甲基化的轮廓，但效应T细胞除外，显示TSDR是检测Treg细胞的有效生物标记物[41]。最近的研究已经破译了一系列的低甲基化基因(Foxp3、Ctla4、Ikzf4和Ikzf2)也受到Foxp3启动子区允许的组蛋白修饰的调节[42-45]。另外研究显示DNA低甲基化可能增加Foxp3等调控基因的表达[46]。CBP和p300是两种组蛋白乙酰转移酶，在稳定Treg细胞系和分化方面发挥了重要作用[47]。组蛋白脱乙酰酶(HDACs)是产生组蛋白脱乙酰的重要酶，当CD4+T细胞缺乏HDAC5时，细胞产生减少，Treg细胞减少[48]。

1.4.4代谢调节 通过液相色谱和气象色谱分析表明，Th17 CD4+T细胞中丙酮酸和乳酸水平更高而在Treg细胞亚群中柠檬酸中间体水平更高但长链脂肪酸的水平较低，表明了糖酵解、OxPhos和FAO在不同T细胞亚群之间的差异[49]。通过抑制或去除PDH抑制剂PDHK1[丙酮酸脱氢酶(PDH)激酶1]来增加丙酮酸氧化，增加OxPhos产生的ROS水平，选择性地将Th17 CD4+T细胞的分化转移到Treg表型[49]。Franchi等[50]发现Th17细胞体内糖酵解和PDHK1生成的水平更低，体内Th17细胞在产生细胞因子后主要依靠OxPhos。Cdc42是Rho家族的GTPase，是Th17 CD4+T细胞糖酵解的另一修饰因子。Cdc42缺失使得致病Th17 细胞的分化增强，表现为RORγt、IL-17、IL-23R和IFN-γ增加；同时减少Treg发展和稳定降低,并增加对肠道的损伤和炎症[51]。除了葡萄糖，Th17 CD4+T细胞也可以通过谷氨酰胺分解利用谷氨酰胺作为能量来源。这个过程是由转录因子ICER调节,通过控制表达GLS1(一种酶,能够使谷氨酰胺转化为谷氨酸和天冬氨酸,随后转化为丙酮酸、α酮戊二酸)完成[51]。另外一些信号蛋白和转录因子也对Th17细胞反应的代谢变化进行了精细的调控，例如IL-23通过下调清道夫受体CD5L的表达引起Th17细胞致病；Th17 CD4+T细胞利用的生物能途径也依赖于环境，并受到环境因素的影响，高脂肪饮食的小鼠体内Th17 CD4+T细胞的频率更高，对自身免疫性疾病的易感性也更高，如EAE或DSS诱发的结肠炎在肥胖小鼠体内加重[52,53]。

1.5Tfh细胞分化机制

1.5.1细胞因子 Tfh细胞是一种新型的辅助T细胞，能够促进B细胞分化成熟，诱导生发中心，促进浆细胞和记忆B细胞的成熟[54]。最近研究表明，IL-6、IL-12、IL-21等细胞因子在Tfh细胞发育中起着至关重要的作用。在小鼠中，IL-6、IL-21通过激活STAT3调节Tfh细胞，IL-12参与其中的早期过程。而在人体中，IL-12通过激活STAT4促进Bcl-6表达，并且诱导原始CD4+T细胞高表达IL-21、ICOS、CXCR5的作用更加明显[55，56]。缺乏IL12Rβ1(IL-12受体β1链，是IL-12和IL-23的一种常见受体)的受试者显示出血液中记忆Tfh细胞和记忆B细胞减少以及淋巴结GC形成的改变[56]。另外，TGF-β在人类Tfh分化中也起着重要作用，首先在TGF-β的参与下，IL-12与IL-23通过刺激原始CD4+T细胞促进多种Tfh分子(包括CXCR5、IL-21和Bcl-6)的表达[55，56]；另外TGF-β也通过强烈抑制Blimp-1(一种抑制Bcl-6功能的转录抑制因子)的表达促进Tfh的产生[55]。然而在小鼠模型的研究中TGF-β抑制IL-21、ICOS以及Bcl-6的表达[55]；另外，TGF-β通过miR-10a负性调节影响Bcl-6表达[57]。表明TGF-β的正向调节可能局限于人体体外研究。

1.5.2转录因子 Bcl-6是识别Tfh的标志之一，Bcl-6缺失的CD4+T细胞不能分化为Tfh细胞，提示Bcl-6是Tfh特异性转录因子。Bcl-6在Tfh中的强制表达可促进CXCR5、CXCR4和PD-1的表达。一项研究显示Bcl-6以IL-21和IL-6独立的方式调控Tfh细胞早期分化。Bcl-6可以与多种迁移相关基因的启动子和增强子结合(如CCR7、CCR6、CXCR5、CCR4、PD-1、PSGL-1)[58]。Blimp-1在Tfh细胞分化中起拮抗作用，并且是其他效应细胞如Th1、Th2、Th17及Treg的重要转录因子。在小鼠研究中，Blimp-1缺失的CD4+T细胞在体内优先发育为Tfh细胞，而Blimp-1表达的CD4+T细胞不能帮助生发中心的形成。因此，与其他效应细胞由Blimp-1参与调控分化不同，Tfh细胞分化是由Bcl-6调控[59]。此外，Blimp-1表达的同时能够抑制Bcl-6的表达，表明Bcl-6和Blimp-1是Tfh细胞的拮抗调节因子。STAT3被发现对Tfh分化至关重要，小鼠STAT3缺失T细胞中IL-21减少，STAT3突变也减少了体内Tfh细胞的产生[59]。同时，在CD4+T细胞STAT3敲除小鼠中，在KLH免疫后，发现几个CXCR5+Tfh细胞有GCs缺陷以及IgG和IgM抗体减少[60]。在STAT3缺失小鼠中，Cxcr5和Icos基因表达下调而Blimp-1的表达上调[61]。更直接的证据是，STAT3可以与Ikaros锌指转录因子Aiolos形成复合物调节Bcl-6的表达[62]。如上所述，已经发现TGF-β对STAT3和STAT4启动Tfh细胞分化提供了重要信号，强调了STAT3在Tfh细胞发育中的重要作用。

1.5.3表观遗传修饰 Tfh细胞的分化同样受到表观遗传修饰调控。通过DNA去甲基化，与基因位点结合的Bcl-6分别与转运甲基胞嘧啶双加氧酶1(TET1：一种羟甲基转移酶)和5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)减少有关[63]，而IL-21增加TET2在Bcl-6启动子区的富集，从而解释了狼疮T细胞中Bcl-6水平的升高[64]。甲基化的H3K27已被报道可以阻止基因表达，而H3K27me3去甲基化酶UTX可以维持细胞和抗体的产生[65]。Tfh细胞的Bcl-6位点检测到了阳性组蛋白修饰，但其他Th亚群的Bcl-6位点则是阴性标记。在Tfh细胞中，miR-17-92簇下调，这可能导致Bcl-6的过度表达，而miR-155能调节miR-146a缺陷小鼠Tfh细胞的积累，导致Tfh细胞的异常积累[66]。miR-146a可直接靶向ICOS，miR-146a的丢失介导ICOS的过度表达导致Tfh细胞的自发和自主积累[67]。越来越多的证据表明，Tfh细胞具有可塑性，这可以通过表观遗传调控来解释。

1.6Th22细胞分化机制

1.6.1细胞因子 Th22细胞是一类参与固有免疫和适应性免疫的新型辅助T细胞。Th22细胞最初在2009年被发现，能够分泌多种细胞因子，最重要的是IL-22。另一方面，Th22细胞可以表达趋化因子受体CCR4、CCR6、CCR10和成纤维细胞生长因子亚型。Th22细胞不表达IL-17、IFN-γ和IL-4等细胞因子[68]，在人类中，细胞因子IL-23、IL-12、IL-6及TNF-α促进IL-22的表达，而TGF-β抑制其表达，这可能归因于TGF-β激活的转录因子c-Maf的抑制功能[69]。

1.6.2转录因子 如上所述，Th22细胞不表达IFN-γ、IL-17及IL-4等细胞因子，也不表达T-bet(Th1相关转录因子)、GATA3(Th2相关转录因子)，仅表达少量RORγt(Th17相关转录因子)，然而，转染RORγt并不促进人类CD4+T细胞表达IL-22。已经发现一种独特的转录因子芳烃受体(AHR)介导Th22细胞的发育[70]。研究表明，刺激AHR可以通过notch信号促进IL-22产生[71]。

1.6.3表观遗传修饰 当前关于表观遗传修饰调控Th22细胞分化的研究还没有一个明确的进展，有待深入研究，挖掘之间的相互关系，从而为Th22细胞分化调控机制的多方面了解提供基础，为Th22细胞在自身免疫性疾病的发病机制研究提供帮助。

1.7Treg细胞分化机制

1.7.1细胞因子 Treg细胞的作用是限制免疫反应，从而防止自身免疫和其他有害的免疫反应。根据起源不同，Treg被分成两个不同的子集，包括自然Treg(nTreg)细胞和适应性Treg(iTreg)细胞，nTreg细胞来自胸腺，iTreg细胞来自外周T细胞。胸腺发育依赖于TCR联合CD28共刺激，CD28对周围nTreg稳态增殖和存活也至关重要。相比之下，iTreg的发展需要IL-2和TGF-β参与。TGF-β信号转导磷酸化激活转录因子SMAD2和SMAD3，然后与Foxp3位点结合，诱导Foxp3基因的表达，促进Treg细胞分化；IL-2信号磷酸化STAT5，STAT5与Foxp3位点结合，诱导Foxp3表达，维持Treg细胞的稳定。

1.7.2转录因子 Foxp3是Treg的重要转录因子，对维持Treg的功能和谱系特征至关重要。Foxp3的转录能够被STAT5激活，IL-2激活的STAT5通过直接与Foxp3基因结合并诱导其表达，在维持Treg分化过程中发挥重要作用。TGF-β减少Foxp3基因中关键CpG岛甲基化，从而使Foxp3的表达增加。另外Foxp3可以绑定并阻止RORγt功能，进而减少Th17细胞的发展。RUNX1通过与Foxp3结合促进诱导Treg，形成RUNX1/Foxp3复合物维持Foxp3表达。在缺乏Foxp3的情况下，RUNX1和RORγt相互作用占据优势，增强Th17细胞分化和IL-17表达。近年来，多项研究发现一些转录因子可以通过作用于Foxp3基因调节Treg表达。NF-κB家族成员c-Rel绑定到Foxp3启动子上一个保守的非编码序列CNS3，促进Foxp3基因的表达。NFAT和SMAD3是诱导Foxp3基因表达并调控CD4+CD25+Treg分化的关键转录因子，两者都是Foxp3增强子区域组蛋白乙酰化和Foxp3表达诱导的重要因素。转录因子BACH2作为免疫激活的广泛调节因子，帮助维持Treg细胞，同时抑制与CD4+T细胞其他效应群分化相关的基因[72，73]，缺失BACH2的情况下，Treg细胞的FOXP3表达数量减少[73]。Nr4a核受体也被证明对Treg细胞的发育至关重要，Nr4a核受体激活Foxp3启动子[74]，Nr4a缺陷小鼠由于严重的自身免疫而早亡。GATA-3通过直接结合和促进Foxp3基因顺式调控元件的活性来控制Foxp3的表达[75]。转录因子ETS-1可与Foxp3内含子增强子相互作用，是nTreg细胞发育所必需的[76]。

1.7.3表观遗传修饰 与Tconv细胞相比,Treg细胞具有独特的增强子结构和DNA甲基化模式，它与Tconv细胞共享大多数活性增强子和DNA低甲基化区域，但只有少数Treg特征基因周围被发现是Treg细胞特异性的，如Foxp3、Il2ra和Ctla4[77,78]。通过研究tTreg细胞发育过程中的阶段特异性表观遗传学变化，证明了大部分Treg特异性增强子，特别是在Foxp3被表达之前，与许多Treg特征基因相关的Treg特异性超增强子(Treg-SEs)在前体阶段逐渐平行激活[77]。激活Treg-SE的一个重要因素是基因组组织者Satb1，Satb1缺乏的CD25+Foxp3-CD4SP胸腺细胞分化为Treg细胞的失败均提示Satb1依赖性增强子的激活对tTreg细胞的发育至关重要，它与另一种启动增强子的酶MLL4共同占据Foxp3位点上新发现的保守增强子区CNS0，从而影响Treg细胞分化[77,78]。Tet2和Tet3已经被证明可以控制DNA的去甲基化，但在现阶段不是Foxp3诱导所必需的[40]。

1.7.4代谢调节 由于mTORC1活性升高，新近分离的人类Treg具有高糖酵解潜能，AMPK磷酸化水平低，对TCR刺激反应迟钝。这种失能状态由依赖mTOR的瘦素产生来维持，能够限制Treg细胞功能[79]。在被激活的小鼠Treg细胞中，Foxp3通过抑制糖酵解和促进乳酸向丙酮酸的氧化来诱导向OxPhos的转移[80]。Treg的迁移依赖于CD28信号诱导的糖酵解，通过mTORC2上调葡萄糖激酶(GCK)。GCK或Rictor的缺失破坏了Treg细胞向皮肤移植物的迁移，导致移植物排斥[81]。Treg特异性Cdc42的缺失也导致糖酵解和脂肪酸氧化相关基因的增加，从而减少了Treg的诱导发育[82]。Treg细胞在谷氨酰胺缺乏的情况下迅速成长，Foxp3+细胞中mTORC1活性的破坏导致抑制功能的丧失和严重的自身免疫性疾病；Raptor缺陷Treg表现为胆固醇和脂质生物合成的减少，从而干扰了Treg的抑制活性。肉碱棕榈酰转移酶-1 (CPT1)是脂肪酸氧化的限速酶，在Tregs中也有高表达，阻断CPT1会损害体外Treg分化[79]。丁酸盐是由共生体微生物产生的短链脂肪酸，通过抑制组蛋白去乙酰化酶，增加Foxp3位点组蛋白乙酰化水平，从而支持体内外Treg的生成。缺乏LKB1的Tregs表现为抑制功能减弱、氧化磷酸化电位降低和ROS生成减少，呈现典型的与Th17 CD4+T细胞相关的代谢特征[83，84]。

2 T细胞分化与疾病进展

CD4+T细胞在保护机体免受病原体侵害方面起着核心作用，但同时它们也参与炎症和自身免疫性疾病的发病。多发性硬化症是一种自身免疫性疾病，其发生发展的确切发病机制尚不明确，但CD4+T细胞在MS的发生发展中起着核心作用。既往,MS被认为是Th1介导的免疫性疾病,最近的研究表明Th17细胞在MS和实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)发病机制中起着关键作用，同时Treg通过改善自身免疫性脑脊髓炎的发生、发展发挥着保护作用[85]。系统性红斑狼疮(SLE)是一种潜在的危及生命的自身免疫性疾病，SLE患者Tfh细胞和Th17细胞较多，支持自身抗体的产生，参与促炎环境，导致先天免疫细胞引起组织损伤；而Treg细胞较少。因此，抑制TFH和Th17细胞的功能，促进Treg细胞的功能，可能会恢复SLE个体的免疫平衡。自身免疫性溶血性贫血(AIHA)是由抗红细胞自身抗体对红细胞破坏增加引起的；Th17细胞被认为是AIHA发展的关键效应因子，Th17细胞增加，IL-17分泌增加与AIHA患者的疾病活动密切相关。中和AIHA大鼠模型体内IL-17可消除发病[86]。再生障碍性贫血(AA)是一种骨髓造血干细胞减少，导致外周血细胞减少。目前认为T细胞介导的自体免疫失衡是导致获得性AA发生的主要原因。炎症性肠病(IBD)是一组复杂的疾病，CD4+T细胞被认为是炎症性肠病(IBD)的主要驱动因素，在肠道炎症,IFN-γ结合另一个Th1相关细胞因子TNF,推动肠道上皮细胞β连环蛋白信号,限制他们的分化和增殖[87]。

3 T细胞亚群分化与药物研发的关系

利用Th1和Th17细胞因子在抗髓过氧化物酶肾小球肾炎不同阶段的基因表达可进行相适宜的单克隆抗体治疗[88]。相关研究证明，由5种益生菌混合而成的IRT5益生菌可通过降低致病性细胞因子的产生抑制Th1和Th17细胞在周围免疫系统和中枢神经系统的作用并增加IL-10的表达从而对EAE起到改善作用[89]。青蒿素-羟基氯喹联合治疗通过降低Th2和Th17细胞分化程度并且升高Th1和Treg细胞分化程度调节大鼠CD4+T细胞亚群的分化从而减轻IgA肾病大鼠肾脏损伤[90]。另外研究表明，给予活动期SLE患者低剂量重组人白介素-2可增加Treg细胞数量，提高其功能；并且减少Tfh、Th17数量，降低其功能来降低SLE疾病活性[91]。在EAE小鼠模型中，使用PDHK1抑制剂(DCA)治疗可通过减少浸润到脊髓的CD4+T细胞数量和增加引流淋巴结中的Treg细胞数量来改善疾病严重程度[92]。

4 总结

CD4+T细胞分化为多个亚群需要一系列因素调控，包括细胞因子、细胞特异性转录因子、表观遗传修饰及代谢的多因素表达。在这里，我们讨论了Th1、Th2、Th9、Th17、Th22、Treg和Tfh细胞中辅助T细胞分化网络。深入研究细胞因子、转录因子、表观遗传学及代谢对Th细胞分化的调控机制，有助于对辅助T细胞更深层次的了解，并探讨不同亚群分化对自身免疫性疾病的影响，针对Th细胞亚群分化调节机制的药物研发，从而有助于开发新的疾病治疗方法，为解决当代自身免疫性疾病提供思路。